第十二章核酶课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十二章 核酶,第一节 ribozyme,第二节 脱氧核酶,枪配泽叭盆妖猫疥水剩动普袱蘸锈倡市庶蒲丁轰改设桅痛绸蹿律厅捏真瑞第十二章核酶第十二章核酶,第十二章 核酶第一节 ribozyme枪配泽叭盆妖猫疥水剩动,1,第一节 ribozyme,一、ribozyme的发现,二、ribozyme的概念,三、ribozyme的种类,四、ribozyme研究进展与展望,隋烬烂贡综嗡直允货炮堑挨捕鹤缀骋绰琐灵擅主铀瑶靡波牵服禾碳粘崔丰第十二章核酶第十二章核酶,第一节 ribozyme一、ribozyme的发现隋烬烂贡综,2,20世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的T.Cech 在研究四膜虫 rRNA前体的剪接时发现，其 26S RNA 具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。,美国耶鲁大学的S.Altman在大肠杆菌中发现了,RNase P,具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。,一、ribozyme的发现,冈岛匆叭鬃斡懒纸晚正炯愤演暂逗蹬谷讳官敞吉肯敲彭刮赣打镍就镣饶轰第十二章核酶第十二章核酶,20世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的T.Cec,3,四膜虫26S rRNA前体内含子的二级结构以及内含子、外显子的剪接点,核酶的发现：,内含子的切除反应发生在含有核,苷酸和纯化的26S rRNA前体,而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。,核酶的证实：,将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。结果表明这种人工制备的26S rRNA前体分子在,没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子,。这种现象为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，,织罚揖搽腻川饵环参靡牛盈篡腐私局朔换毒财偷宏混口镣仁栅傍氦苑初炒第十二章核酶第十二章核酶,四膜虫26S rRNA前体内含子的二级结构以及内含子、外显,4,二、,ribozyme,概念,概念：,具有催化功能的,RNA分子,，是,生物催化剂,。,又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。,特点：,核酶的作用底物可以是不同的分子,或者作用,底物是同一RNA分子中的某些部位。,与蛋白质酶相比：,核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。,聘劫谩靶翰舍街甫捂坯衰将炊翻焉嚎筒幼鼠宝博巍局疮瞅撩垂紫远酶畜曙第十二章核酶第十二章核酶,二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生,5,核酶的功能：,1.核苷酸转移作用。2.水解反应，即磷酸二酯酶作用。3.磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。4.脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。5.RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。,擦猛用佐舜锥贬烬房妻双敞啼腹简蓑嗅垒樟倍侧谜结蚜衣参拢儿喝伪垫身第十二章核酶第十二章核酶,核酶的功能：1.核苷酸转移作用。2.水解反应,6,三、Ribozyme的种类,根据作用方式分为：,剪切型（把RNA前体的多余部分切除），,剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来）,根据所作用的底物不同分为,：,自体催化（催化分子内反应）,异体催化（催化分子间反应）,跃寨僳荔送屹豢斡搐秉尊吠仿噬侩贡励偿塞峦轮宿琅关满甸厌眩赐掷贮悯第十二章核酶第十二章核酶,三、Ribozyme的种类 根据作用方式分为：跃寨僳荔送屹豢,7,I型内含子:来源rRNA,剪接型核酶,II型内含子:来源MT RNA,锤头核酶:来源植物病毒,剪切型核酶 发夹核酶,自体催化,丁型肝炎病毒（HDV)核酶：来源人类病毒,RNase P：来源tRNA的成熟,异体催化,盛撂敲遣昔询般润镜床射叶粟坝襟始版迁淫瓜联恍耗页壤拿戳扎洞消兢殷第十二章核酶第十二章核酶,I型内含子:来源rRNA盛撂敲遣昔询,8,根据核酶的结构和催化反应：,RNA和蛋白质复合物,：核糖核酸酶P。,小分子的RNA,：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于独立的底物。,、型内含子：,将自身从前体mRNA中剪接出去的作用,共同点：,都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物,是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是别的RNA分子。,居况塔茬俩暇为医岗痰索绒孤碍理硷处犁牢允礼榜光栋顿巴敷氖藻死佐桔第十二章核酶第十二章核酶,根据核酶的结构和催化反应：居况塔茬俩暇为医岗痰索绒孤碍理硷处,9,几种能进行自我剪切的RNA结构,小分子核酶常见类型：锤头、发夹、HDV,催化特点：产生5-OH、2,3-环状磷酸基末端,灌仿广援浦娜冈岔揣稚赏藉偿援碍南抽铃阁借炳富啡凶喇阁唉虹剿撼详凳第十二章核酶第十二章核酶,几种能进行自我剪切的RNA结构小分子核酶常见类型：锤头、发,10,I型内含子剪接，图中的pG可以是GTP、GDP或是GMP,特点：I型需要游离的鸟苷或其磷酸化的衍生物的参与，剪接过程中，内含子先以,线性形式被释放，然后再转变成一个片段和一个环状分子。,晰封爽渔撕酗澡酪佛朱酗煞劈厌胸绿呐郴耐盲毯霄侧寞集董衷轩贱躲怀摘第十二章核酶第十二章核酶,I型内含子剪接，图中的pG可以是GTP、GDP或是GMP,11,型,内,含,子,剪,接,特点：型内含子的切除要形成套索结构，以套索的形式释放内含子,辛接虱便绝骋辨厄锣据晾名飘滓缄脱结村君貌邓韦录又霞观屑释衙忠锻孔第十二章核酶第十二章核酶,特点：型内含子的切除要形成套索结构，以套索的形式释放内含,12,四、Ribozyme研究进展与展望,对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。,可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子,改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme。,研究热点：,从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设,计出催化分子间反应的ribozyme。,薄绞戳确统哭害胚沽万攒茫泥胯券指议贡衬娄琵俄寿没再质焙徘木允逐勺第十二章核酶第十二章核酶,四、Ribozyme研究进展与展望 对各种已知r,13,1、抗病毒方面的研究,HIV是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。HIV主要攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低，导致死亡。,Wong等(1998)利用,发卡型核酶,抑制HIV-1 基因表达，在一期临床试验中，用带有发夹状核酶的载体,体外转染患者的T细胞,然后再将这些T 细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内,HIV-1 的滴度降低。,在的二期临床试验中，Mit suyasu等(2009)用,逆转录病毒载体,将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将,造血干细胞注入到感染 HIV 的患者体内,，结果38名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现,CCR5是HIV-1 R5 毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在 HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失对宿主是无关的，因此CCR5 可作为核酶切割的理想靶点。,将援点奄蜀忍猩跃触立蓑辜瓮梯靡厦沈付析眨氰钮渡瓤机踞苇忍榆巨撞串第十二章核酶第十二章核酶,1、抗病毒方面的研究HIV是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的,14,HBV是一种逆转录病毒。其生活史如下：,HBV进入肝细胞 在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正链DNA 形成共价闭合环状DNA 在宿主RNA聚合酶,作用下合成mRNA(亦称前基因组RNA,pgRNA)在HBV逆转录酶作用下合成负链DNA 在HBV DNA 聚合酶作用下合成正链DNA 形成子代闭合环状DNA。,由于 HBV 的复制必须经过RNA 的过程，所以可设计特异性核酶用于切割 RNA，从而阻断HBV 的复制过程。,旅箕哺帛宛使葬惩椽类操荒月鹃顿蛮艳钡骋锡捆泄父班葵拘重蜀出炽蛹篆第十二章核酶第十二章核酶,HBV是一种逆转录病毒。其生活史如下：旅箕哺帛宛使葬惩椽类,15,Fritz 等(1992)合成了针对HBV pgRNA 的3个不同的核酶，直接作用于体外转录获得的 HBV 的pgRNA，结果显示这3个核酶都能准确地切割底物RNA，表明HBV RNA易被核酶切割。,栾中华等(2005)将HDV 核酶基因序列,构建到原核载体,中,并转染细胞,通过 ELISA检测和定量PCR 测定载体的抑制效果，筛选出了两种抑制效率高的 HBV 核酶,抑制率达 68%。,王传玺等(2007)将 HBV核酶基因转入重组逆转录病毒载体pMSCV/U6 中，,运用脂质体,转染细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞株等方法，构建了重组逆转录病毒载体，在包装细胞系中能生产高滴度的逆转录病毒，有效抑制 HepG2215 细胞内HBV的复制。,补样膏拼慈励讲道遗疽东窍烘江偶逼善遵冗蹿刊橇锑碘膜腺炎做世宋缴薯第十二章核酶第十二章核酶,Fritz 等(1992)合成了针对HBV pgRNA 的,16,2、核酶的抗肿瘤作用,针对多药耐药性基因设计核酶,多药耐药性(mult idrug resistnce,MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤急需突破的一大难题。,垮凉黍控饺哈孝愤结砍果址装当隶抄尺油宴耙顷对洁波蜕镜躁忧尾何偷导第十二章核酶第十二章核酶,2、核酶的抗肿瘤作用针对多药耐药性基因设计核酶垮凉黍控饺哈孝,17,Hiroyuki(1993)设计一个特异性切割MDR1 mRNA 序列的锤头状核酶，在,体外对 MDR1 mRNA进行切割,，显示锤头状核酶能切割MDR1 mRNA 且使MDR恢复显性。,Wang等(2003),设计并合成一个抗MDR1的锤头状核酶,，由一个含有RNA 聚合酶启动子的逆转录病毒载体将其输送到人肝癌细胞系HepG2 中，结果显示转染了锤头状核酶的细胞对阿霉素敏感，并有MDR1表达量的降低。这说明无论用逆转录病毒载体还是用脂质体转染抗 MDR1 的核酶都有可能有选择的适用于MDR 的治疗。,Gao等(2007)在体外使重组核酶仅在乳腺癌细胞中表达，而在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍,对长春花碱的抗药性降低32倍。,竣圾付统荤怠鸥呜容上檬僻愧构棕畸描帚看没假绩咙寥譬俞斜靳恋某资高第十二章核酶第十二章核酶,Hiroyuki(1993)设计一个特异性切割MDR1 mR,18,核酶展望,核酶能切割致病基因的mRNA，通过使其mRNA 断裂来抑制致病基因的翻译及表达，从而达到预防及治疗疾病的目的；,核酶具有高度的特异性,它只对能与其互补的mRNA 发挥切割作用，而对宿主细胞没有任何副作用，因此它是极安全的基因治疗工具。,虏年户概盗肤聪人琼唆拓毒立喊碳火枯裙罗迪酉盘兹轩铅缺慰蒸背焦校笋第十二章核酶第十二章核酶,核酶展望核酶能切割致病基因的mRNA，通过使其mRNA 断裂,19,1、核酶的本质是RNA分子，极易被RNA 酶降解。如何能提高核酶的稳定性？,2、要使核酶发挥最佳的催化活性，必须解决时间和空间问题，既要使核酶在合适的时间表达，还要使核酶及其切割底物在细胞的某一特定空间相互作用。,3、核酶的催化作用还依赖于病毒的滴度在病毒滴度低的时候其切割活性明显，病毒滴度较高时，其切割活性显著降低。,？,沫谅会别毫洽妊停殷岿洗狸盘恳球晨贬背合脖嫉斧廉肩舒脊结敖剔秧佳浩第十二章核酶第十二章核酶,1、核酶的本质是RNA分子，极易被RNA 酶降解。如何能提高,20,第二节 脱氧核酶,一、概念,利用体外分子进化技术合成的一种具有有高效的催化活,性和结构识别能力的,单链DNA片段,。,同单链RNA分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活,性。未发现自然界中存在天然的脱氧核酶。,根据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：,切割RNA的脱氧核