演示文稿第三章谷氨酸生产菌的特征育种及扩大培养课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,第三章谷氨酸生产菌的特征育种及扩大培养ppt课件,第一页，共四十七页。,第一页，共四十七页。,目录,contents,1,2,3,4,谷氨酸生产菌的主要特征,国内谷氨酸生产菌及其比较,谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,谷氨酸发酵的代谢控制育种策略,5,利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌,6,菌种的扩大培养及种子的质量要求,第二页，共四十七页。,第二页，共四十七页。,第一节,.,谷氨酸生产菌的主要特征,一、现有谷氨酸生产菌的分类,现有谷氨酸生产菌主要是棒,状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌,属中的细菌。,1.,棒状杆菌属,(,Corynebacterium,),直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成,“,八,”,字形或栅状排列。葡萄糖发酵产酸，,G,+,第三页，共四十七页。,第三页，共四十七页。,2,短杆菌属,(,Brevibacterium,),短的不分枝直杆菌。多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。,G,+,3,小杆菌属,(,Microbacterium,),形态与棒状杆菌相似。发酵葡萄糖产酸弱，主要产乳酸。,G,+,第四页，共四十七页。,第四页，共四十七页。,4,节杆菌属,(,Arthrobacterium,),培养过程中，细胞形态变化较大,球菌 杆菌，杆菌 球菌。,G,+,G,-,G,-,G,+,能液化明胶，从碳水化合物产酸极少或不产酸。,第五页，共四十七页。,第五页，共四十七页。,二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展,谷氨酸棒状杆菌,ATCC 13032,GenBank NC-004369,第六页，共四十七页。,第六页，共四十七页。,第七页，共四十七页。,第七页，共四十七页。,目前应用发酵法生产,L-,乳酸常用的微生物仅有两大类,:,一类为细菌,多采用乳酸菌,另一类为根霉。根霉可以直接利用淀粉质原料生产,L-,乳酸,但是产酸量低,副产物多,转化率低。,Sauer,等构建了包含乳杆菌,L-,乳酸脱氢酶基因的毕氏酵母,它利用木糖发酵,初始浓度为,100g/L,，生产,L-,乳酸达到,58g/L,，比利用葡萄糖产生乳酸的水平高。,基因工程育种（重组,DNA,技术）,第八页，共四十七页。,第八页，共四十七页。,三、现有谷氨酸生成菌的主要特征,（,1,）细胞形态球形、棒状以及短杆状。,（,2,）,G,+,，无芽孢、无鞭毛，不能运动。,（,3,）,需氧型、生物素缺陷型微生物。,（,4,）,脲酶强阳性,（,5,）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶。,（,6,）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。,（,7,）,CO,2,固定反应酶系活力强。,第九页，共四十七页。,第九页，共四十七页。,（,8,）异,柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环弱。,（,9,）,-,酮戊二酸氧化能力微弱。,（,10,）,NADPH2,进入呼吸链能力弱。,（,11,）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。,（,12,）能利用醋酸，不能利用石蜡。,（,13,）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。,（,14,）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸,5%,以上。,第十页，共四十七页。,第十页，共四十七页。,第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较,1,、形态特征,短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。,单个、成对及,“,V,”,字形排列。,G+,。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,一、北京棒杆菌,(AS1299),的形态和生理特征,第十一页，共四十七页。,第十一页，共四十七页。,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，,24h,白色，,48h,淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。,第十二页，共四十七页。,第十二页，共四十七页。,3,、生理特征,对氧的要求：好氧及兼性厌氧。,与温度的关系：菌株,2637,培养生长良好，不耐高温，,41,生长较弱。,pH,的影响：,Ph510,均能生长，最适,pH67.5,。,还原硝酸盐：反映强烈。,石蕊牛奶培养：,7d,后微产碱。,不水解淀粉，,不分解纤维素。,对尿素的耐力，,2.6%,以上生长受抑制。,脲酶试验：强阳性反应。,产酸物质的测定：,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸。,生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。,第十三页，共四十七页。,第十三页，共四十七页。,二、钝齿棒杆菌,(AS1542),的形态和生理特征,1,、形态特征,短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。单个、成对及,“,V,”,字形排列。,折断分裂。,G,+,。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,第十四页，共四十七页。,第十四页，共四十七页。,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。,第十五页，共四十七页。,第十五页，共四十七页。,对氧的要求：兼性厌氧。,与温度的关系：菌株,2037,培养生长良好，不耐高温，,42,不生长。,pH,的影响：,pH69,生长良好，,pH10,生长微弱，,pH45,已不能生长。,还原硝酸盐：反映强烈。,石蕊牛奶培养：,7d,后微产碱。,水解淀粉，不分解纤维素。,对尿素的耐力，,2.6%,以上生长受抑制。,脲酶试验：强阳性反应。,产酸物质的测定：,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸。,生长因素试验：生物素是必需生长因子。,3,、生理特征,第十六页，共四十七页。,第十六页，共四十七页。,三、天津短杆菌,(T613),的形态和生理特征,典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。单个、成对及,“,V,”,字形排列。折断分裂。,G,+,。不运动。无芽孢。,1,、形态特征,第十七页，共四十七页。,第十七页，共四十七页。,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。,第十八页，共四十七页。,第十八页，共四十七页。,3,、生理特征,对氧的要求：好氧及兼性厌氧。,与温度的关系：菌株,2637,培养生长良好，,75,处理,10min,不再生长。,pH,的影响：,pH610,生长良好，,pH5,生长微弱，,pH4,和,pH11,已不能生长。,还原硝酸盐：反映强烈。,不水解淀粉，不分解纤维素。,对尿素的耐力，,5%,以上生长受抑制。,脲酶试验：强阳性反应。,产酸物质的测定：,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵,生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。,第十九页，共四十七页。,第十九页，共四十七页。,四、北京棒杆菌,(7338),与钝齿棒杆菌,(B9),的比较,后提取容易，收率较高，质量较好,分泌色素较多,第二十页，共四十七页。,第二十页，共四十七页。,2.5,天津短杆菌,(T613),与钝齿杆菌,(B9),的比较,T613,感染噬菌体时，不能换用,B9,，调换,7338.,第二十一页，共四十七页。,第二十一页，共四十七页。,第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,斜面和一、二级种子在不同培养条件下，细胞形态基本相似。,斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。,多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝,;,细胞排列呈单个、成对及,“,V,”,字形,有栅状或不规则聚块,;,分裂的细胞大小为,0.7,0.9*1.0,3.4um,。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,一、种子的菌体形态,第二十二页，共四十七页。,第二十二页，共四十七页。,二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态,长菌型细胞：,发酵,0-8h,或,0-10h,。短杆至棒状，有的微弯曲状，细胞单个、成对及,V,字形排列。,转移期细胞：,发酵,8-18h,或,10-20h,。细胞开始伸长、膨大。在生物素贫乏的条件下，,从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型。,转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞。,第二十三页，共四十七页。,第二十三页，共四十七页。,产酸型细胞：,发酵,16-20h,后。细胞为含磷脂不足的异常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏,V,字形排列。发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，产酸高。,过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化。菌体较粗壮，类似于长菌型细胞。典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸。,第二十四页，共四十七页。,第二十四页，共四十七页。,三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏,字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。,第二十五页，共四十七页。,第二十五页，共四十七页。,在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片。,第二十六页，共四十七页。,第二十六页，共四十七页。,第四节、谷氨酸发酵的代谢控制育种,一、日常菌种工作,1,、定期分纯,1-2,个月分离纯化一次,第二十七页，共四十七页。,第二十七页，共四十七页。,2,、小剂量诱变刺激,用紫外线（,10-20s,）处理，可以淘汰生长微弱的菌株，并能,激发溶原性噬菌体,，使挑出来的菌产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染。,第二十八页，共四十七页。,第二十八页，共四十七页。,3,、高产菌制作安瓿管,育种后分纯的高产菌种需保存到安瓿管中，防止菌种变异。,第二十九页，共四十七页。,第二十九页，共四十七页。,二、选育耐高渗透压菌种,耐高糖突变株,选育在含,20-30%,葡萄糖的平板上生长好的突变株。,耐高谷氨酸突变株,选育在含,15-20%,味精的平板上生长好的突变株。,耐高糖、高谷氨酸突变株,选育在含,20%,葡萄糖、,15%,味精的平板上生长好的突变株。,第三十页，共四十七页。,第三十页，共四十七页。,三、选育不分解利用谷氨酸的突变株,选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。,四、选育细胞膜渗透性好的突变株,生物素亚适量,吐温,-60,青霉素,温度敏感株,第三十一页，共四十七页。,第三十一页，共四十七页。,五、选育强化,CO,2,固定反应的突变株,六、选育减弱乙醛酸循环的突变株,七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到,-,酮戊二酸代谢的突变株,八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反,馈调节的突变株,九、选育强化能量代谢的突变株,耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株,第三十二页，共四十七页。,第三十二页，共四十七页。,第五节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,一、应用原生质体融合技术,第三十三页，共四十七页。,第三十三页，共四十七页。,钝齿棒杆菌,B9,(,细胞个体大、易于提取；产酸率低,),天津短杆菌,TG-866,(,产酸率高,),融合子,F263,(,细胞个体大、产酸率高,),第三十四页，共四十七页。,第三十四页，共四十七页。,二、应用转化法,第三十五页，共四十七页。,第三十五页，共四十七页。,三、应用转导法,第三十六页，共四十七页。,第三十六页，共四十七页。,四、应用重组,DNA,技术,第三十七页，共四十七页。,第三十七页，共四十七页。,第六节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一、菌种扩大培养的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,第三十八页，共四十七页。,第三十八页，共四十七页。,二、菌种扩大培养的过程,第三十九页，共四十七页。,第三十九页，共四十七页。,1,、斜面菌种的培养,培养基：葡萄糖,0.1%,，蛋白胨,1%,，牛肉膏,1%,，氯化钠,0.25%,，酵母膏,0.5%,，琼脂,2%,，,pH 7.0-7