蛋白质定性定量分析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2024/11/13,1,蛋白质的定性定量分析,第二章,2024/11/13,2,蛋白质的含量测定,凯氏定氮法：1883年丹麦化学家Kjeldhl建立，经后人改进后形成的一种定量测定蛋白质最为精确、敏感的方法。,原理：蛋白质的含氮量为,16,，只要测出样品中氮的含量，即可计算出蛋白质的含量,样品中蛋白质的含量,N6.25,2024/11/13,3,凯氏定氮的根本流程：,1,、消化：生物样品与浓硫酸共煮，样品蛋白质被无机化，其中氮元素转变为硫酸铵。,Pr,H,2,SO,4,CO,2,H,2,O,(NH,4,),2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,+2NaOH NH,4,OH+H,2,SO,4,NH,4,OH+HCl NH,4,Cl+H,2,O,2024/11/13,4,2024/11/13,5,2024/11/13,6,2024/11/13,7,凯氏法的评价：,优点：,缺点：,1,、适用于一切形态的样品；,2,、不用比色，对混浊不透明的样品也可进行分析；,3,、结果的精、准度较高。,1,、样品中含有非蛋白态氮时影响分析结果；,2,、组成蛋白质的氨基酸可影响分析结果；,3,、操作复杂，对操作者的要求高。,2024/11/13,8,Lowry,法,Lowry法原理：是在双缩脲法和Folin酚法的根底上建立的一种新的蛋白质定量方法。蛋白质在碱性条件下与铜离子反响生成紫红色络合物。然后再与Folin试剂反响生物深蓝色。颜色与蛋白质含量成正比，符合朗伯比尔定律。,2024/11/13,9,方法评价,优点,1,、,可对多个样品同时进行分析，操作简便；,2,、,结合,Folin,酚法，提高了分析的灵敏度；,3、结合双缩脲法，防止了Folin酚法的局限。,缺点,1,、比色测定，要求显色后溶液透明，且样品必需可溶；,2,、酚方式剂在碱性溶液中稳定性差，显色后需尽快比色；,3、干扰反响的因素较多。,2024/11/13,10,0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml,A,0.8,0.6,0.4,0.2,2024/11/13,11,2024/11/13,12,紫外吸收法,原理：蛋白质在紫外区有两个吸收峰，其一为280nm，由芳香氨基酸上共轭双键引起，芳香氨基酸在各种蛋白质的的含量差异不大，测蛋白质溶液在280nm处的吸收值可计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽键引起。可通过215nm与225nm的差值计算出蛋白质的含量。,2024/11/13,13,考马斯亮蓝,G-250,染色法,原理：考马斯亮蓝在一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈现红色，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰从,465nm,移到,596nm,。,优点：1操作简便；2敏感度较高3颜色稳定4对干扰剂不敏感。,缺点：1染料与蛋白质的实际状况复杂，色素与样品中的蛋白质不一定以当量相结合；2要求样品完全溶解；3样品不能回收使用。,2024/11/13,14,蛋白质相对分子量的测定,SDSPAGE法测蛋白质的相对分子量：带电颗粒在电场中的迁移主要受三个因素的作用，即场强、颗粒本身的电荷及分子形状。因此一般电泳无法直接测定蛋白质的分子量。参加变性剂SDS后，蛋白质变性肽链伸展且蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖，在相同的电场下，蛋白质的迁移率只与蛋白质的分子量相关。,2024/11/13,15,lgMr=lgK-bm=K,1,-bm,2024/11/13,16,SDS-PAGE,法测定分子量的操作：,1,、标准蛋白质样品的制备：按商品说明书使用。,2、待测样品的制备：取待测蛋白质样品0.5mg，参加0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)1ml溶解。与标准蛋白质一起参加等体积的样品缓冲液，混匀，沸水浴加热3分钟后上样。,3、电泳别离及染色：,2024/11/13,17,4,、计算相对迁移率：,Rf=,蛋白样品移动距离,(cm),指示染料移动距离,(cm),2024/11/13,18,2024/11/13,19,2024/11/13,20,凝胶过滤测蛋白质分子量：测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。将分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于参加凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。,2024/11/13,21,2024/11/13,22,Ve,K,1,K,2,logMr,2024/11/13,23,2024/11/13,24,2024/11/13,25,方法的局限性：,1、在pH68的范围内，直线关系比较好，在极端pH时因蛋白质变性而引起偏离；,2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋白质的轴比较大时，会引起测定偏离；,3,、糖蛋白的含糖量大于,5,时，测得的分子量比真实分子量大。,2024/11/13,26,2024/11/13,27,沉降速度法,S,沉降速度,离心力,dx/dt,2,x,1,dt,2,dx,x,m=,SRT,D(1-),2024/11/13,28,沉降平衡法,m=,2RTln(C,1,/C,2,),(1-),2,(X,2,2,-X,1,2,),2024/11/13,29,等电聚焦测定蛋白质的等电点,等电点分析：电泳结束后三氯乙酸固定并除去凝胶中的载体两性电解质，考马斯亮蓝,R,250,染色，漂洗显带后测定蛋白质等电点。,1、利用等电点标准蛋白质的等电点为纵坐标，距正极的距离为横坐标作图得标准曲线，在此标准曲线上根据待测样品的位置求出其等电点；,2024/11/13,30,2、利用微电极直接测定凝胶外表的pH而得知样品的等电点；,3,、将凝胶切成等距离,(5nm),的小块，浸于水中，用精密试纸测定,pH,。以凝胶块距正极的距离为横坐标，,pH,为纵坐标作用图得出胶的,pH,梯度曲线。根据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋白质样品的等电点。,2024/11/13,31,其它蛋白质定性定量分析技术,蛋白质的电泳染色定量分析,特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最早应用于血浆蛋白电泳别离后白蛋白和球蛋白的比例测定。其方法有二，其一是将染色后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各峰面积比而得出各成分的相对含量。,与含量的标准蛋白一起电泳染色扫描后与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。,2024/11/13,32,2024/11/13,33,2024/11/13,34,2024/11/13,35,免疫印迹技术的根本操作(例PKC),1,、细胞裂解物的制备,2,、细胞裂解液蛋白含量测定,3,、细胞裂解物,SDS,PAGE,电泳,4,、蛋白质转膜,5,、目的蛋白的检测,2024/11/13,36,2024/11/13,37,