1.2--基因工程的基本操作程序

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2 基因工程的基本操作程序,步骤一：,目的,基因,的获取,目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所,需要转移,或,改造,的基因。,如苏云金芽孢杆菌的,抗虫基因,，植物的,抗逆性相关的基因，,以及人的,胰岛素基因、干扰素基因,等。,从已有的物种中分离,人工方法合成,从基因文库获得,基因组文库,部分基因文库,利用,PCR,技术扩增,DNA,合成仪用化学方法直接人工合成（基因小、核苷酸已知）,1,、从基因文库中获取目的基因,基因文库,:,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库,(gene library),。,基因组文库,:,基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。,部分基因文库,:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。,某生物体内,全部,DNA,许多,DNA,片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接 导入,基因组文库,某种生物某个时期的,mRNA,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接 导入,部分基因文库,（,cDNA,文库）,外显子,内含子,与,RNA,聚合酶结合位点,编码区,非编码区,非编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶结合位点,编码区,原核生物基因,真核生物基因,内含子,外显子,真核生物,cDNA,文库与的区别基因组文库,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,种间的基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物,部分,基因,某种生物,全部,基因,可以,部分基因可以,2,、,利用,PCR,技术,扩增目的基因,聚合酶链式反应，在生物体外复制特定,DNA,片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,循环,（,重复,）,变性,退火,延伸,使目的基因短时间内成百万倍地扩增,PCR,技术的原理：,DNA,复制,(,体外,),过程：变性 退火 延伸,（解链为单链）（冷却）（子链合成）,条件：,引物（,2,种）；,模板,:DNA,的两条链,；,四种脱氧核苷酸；,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）。,多次重复,PCR,技术与,DNA,体内复制的区别：,DNA,复制,(,体内）,PCR,技术,引物,解旋,酶,操作环境,需要,需要,常温条件、解旋酶、,ATP,高温条件（,9095,）,DNA,解旋酶、,DNA,聚合酶、,耐高温的,Taq,酶,体内（细胞内）,体外,练习有关,PCR,技术的说法，不正确的是,(,）,A,PCR,是一项在生物体外复制特定的,DNA,片段的核酸合成技术,B,PCR,技术的原理是,DNA,双链复制,C,利用,PCR,技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,D,PCR,扩增中必须有解旋酶才能解开双链,DNA,（,1,）催化过程的酶是,_,。,（,2,）过程也称为,DNA,的变性，此过程在温度高达,9095,时才能完成，说明,DNA,分子具有,_,性。,（,3,）由图中信息分析可知，催化过程的酶都是,_,，两者在作用特性上的区别是,_,。,（,4,）如果,RNA,单链中有碱基,100,个，其中,A,占,25%,，,U,占,15%,，则通过该过程合成的一个双链,DNA,片段中有胞嘧啶,_,个。,70,75,RNA,单链,杂交双链,RNA,链,DNA,链,核酸酶,H,单链,DNA,双链,DNA,90,95,55,60,反转录酶（或逆转录酶）,练习：,1970,年，特明和巴尔的摩证实了,RNA,病毒能依赖,RNA,合成,DNA,的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成,cDNA,的过程和,PCR,扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：,稳定,DNA,聚合酶,催化过程的酶耐高温,60,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,3.,通过,DNA,合成仪,化学方法直接人工合成,（基因比较小、核苷酸序列又已知）,步骤二：,基因表达载体的构建,（核心内容）,（,1,）用一定的,限制酶切割质粒,，使其出现,一个切口,，露出,黏性末端,。,（,2,）用,同一种,限制酶,切,割,目的基因,，使其产生,相同的黏性末端,。,（,3,）将切下的目的基因片段,插入质粒,的切口处，再加入适量,DNA,连接酶,，形成了一个,重组,DNA,分子,（重组质粒）。,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的,基因重组的过程,。,步骤二：,基因表达载体的构建,（核心内容）,获取目的基因,同一种限制酶切割,DNA,连接酶,产生相同的,末,端,重组,DNA,1.,表达载体的构建过程,C T T A A G,G A A T T C,C T T A A G,G A A T T C,C T T A A G,G,G,G A A T T C,质粒,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的,基因重组的过程,。,步骤二：,基因表达载体的构建,（核心内容）,2.,表达载体的组成,启动子：,+,目的基因：,+,终止子：,标记基因：,+,是,的结合位点，,驱动,过程。,RNA,聚合酶,转录,终止,过程。,转录,有目的基因的受体细胞。,鉴定和筛选,编码人类所需的蛋白质,使生物表达相应性状,.,复制原点：,启动复制,质粒,DNA,分子,限制酶处理,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,基因表达载体的组成,复制原点,+,启动子,+,目的基因,+,终止子,+,标记基因,思考:,1.,上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗？,都是,DNA,2.,终止子和终止密码的化学成分是否一致？,终止子,DNA,终止转录,;,终止密码,RNA,上，终止翻译,.,3.,图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶,EcoRI,、,BamHI,的酶切位点，,amp,R,为青霉素抗性基因，,tct,R,为四环素抗性基因，,P,启动子，,T,为终止子，,ori,为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括,EcoRI,、,BamHI,在内的多种酶的酶切位点。,据图回答：,（,1,）将含有目的基因的,DNA,与质粒该表达载体分别,用,EcoRI,酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由 两个,DNA,片段之间连接形成的产物有,、,、,三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进,行,.,（,2,）用上述,3,种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是,；,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,目的基因目的基因连接物,分离纯化,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,练习,.,图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶,EcoRI,、,BamHI,的酶切位点，,amp,R,为青霉素抗性基因，,tct,R,为四环素抗性基因，,P,启动子，,T,为终止子，,ori,为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括,EcoRI,、,BamHI,在内的多种酶的酶切位点。,（,3,）目的基因表达时，,RNA,聚合酶识别和结合的位点是,，其合成的产物是,。,（,4,）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶,是,。,EcoRI,和,BamHI,启动子,mRNA,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,转化：,指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内,维持稳定和表达的过程,。,转化,1.,将目的基因导入植物细胞,（,1,）农杆菌转化法：,感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力；,（,2,）基因枪法,：常用于单子叶植物；,（,3,）花粉管通道法,：转基因抗虫棉。,（,2,）基因枪法,：常用于单子叶植物；,花的结构示意图,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱头,花药,花丝,雄蕊,雌蕊,（花冠）,（,3,）花粉管通道法,：转基因抗虫棉。,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术：,利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。,3.,将目的基因导入微生物细胞,导入大肠杆菌的方法,:,首先用,Ca,2+,处理细胞,，,以,增大细菌细胞壁的通透性,，,使细胞处于一种能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态,感受态细胞,。,第二步是将,重组表达载体,DNA,分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,，在一定的温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子，完成转化过程。,显微注射技术,提纯基因表达载体,体外显微注射入受精卵,受精卵移植,采用氯化钙来改变其通透性是为了制感受态细胞，原理是，用低渗,CaCl2,溶液在低温（,0,）时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源,DNA,分子在此条件下易形成,抗,DNA,酶的羟基钙磷酸复合物,粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对,DNA,的吸收。,蔡信之微生物学,181,页，两种理论都是假说，,1,、局部原生质化，也就是,细胞壁,上出现孔，,2,、好像还涉及细胞表面的转化因子（分子量,5000-1-0000,）的蛋白质的形成和细胞表面受体结合的转运问题。,刘祖洞得遗传书下册，,174,页,，,用钙离子处理使,细胞膜,上出现漏隙，,DNA,容易进入。,目前常用的对原核细胞的转化方法有两类：电穿孔转化法、化学转化法。电穿孔转化法属于物理方法，不需要对细胞进行特殊处理，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。化学转化法是利用低温,（,0,）和氯化钙（,CaCl2,）,低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源,DNA,的状态，即感受态（,competence,），此时菌体膨胀成球形，,细胞壁和膜的通透性增强。,重组,DNA,与,Ca2+,形成的羟基,-,磷酸钙复合物黏附于菌体表面，经,42,短暂的热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组,DNA,被吸收进入宿主细胞。,然后在营养丰富的的培养基上生长,1,小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。,体外重组的,DNA,分子，需按一定的方式导入宿主细胞，通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。在基因克隆技术中，转化,(transformation),特指质粒,DNA,或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。,大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）及转化,细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为,15-30nm,。主要成分是肽聚糖，由,N-,乙酰葡糖胺和,N-,乙酰胞壁酸构成双糖单元，以,（,1-4,）糖苷键连接成大分子。,N-,乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。革兰氏阳性菌细胞壁厚约,20,80nm,，有,15-50,层肽聚糖片层，每层厚,1nm,，含,20-40,的磷壁酸（,teichoic,acid,），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约,10nm,，仅,2-3,层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。此外，外膜与细胞之间还有间隙。肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。如溶菌酶是,N-,乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制转肽酶的活性，