岛津LC-10AT型HPLC操作规程2

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,第一节,岛津LC-10AT型HPLC操作规程,1,目的:标准岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。,范围:适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。,职责:操作员对本规程的实施负责。,2,一、,系统组成,本系统由,1,个LC-10ATvp溶剂,输送泵,、Rheodyne 7725i手动,进样阀,、SPD-10Avp紫外-可见,检测器,、N2000色谱数据,工作站,和,电脑,等组成，另外还包括打印机。,3,二、,准备,1、准备所需的流动相，用适宜的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。,2、根据待检样品的需要更换适宜的色谱柱注意方向和定量环。,3、配制样品和标准溶液，用适宜的0.45m滤膜过滤。注意腐蚀性与有机系的的溶剂,4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,4,接通电源，依次开启不间断电源、泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，翻开打印机、电脑显示器、主机，最后翻开色谱工作站。,三、,开机,5,四、,参数设定,1、波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按func键1次，波长数字键闪动，输入所需波长值，按Enter键确认。按CE键退出到初始屏幕。,2、流速设定：在泵显示初始屏幕时，按func键，用数字键输入所需的流速流速一般为超过1ml/min，按Enter键确认。按CE键退出,6,五、,更换流动相并排气泡,1：将管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；,2：逆时针转动泵的排液阀180，翻开排液阀；,3：按泵的purge键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的高流速冲洗，3min可设定后自动停止，一般视管路无气泡即可。,4：将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。,5：如管路中仍有气泡，那么重复以上操作直至气泡排尽。,6：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按pump键，冲洗3min后再按pump键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。,7,六、,平衡系统,1、查看基线：,1.1：按?N2000色谱数据工作站操作规程?翻开“在线色谱工作站软件，,1.2：输入实验信息并设定各项方法参数后，,1.3：按下“数据收集页的 按钮。,8,六、,平衡系统,2、,2.1：按泵的pump键，泵启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。,2.2：检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。,2.3：观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过那么可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。,2.4：观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L,的缓冲液,4.,每天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调节流动相,6.,采用保护柱,38,二、保存时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度增加,1.,检查泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,39,三、保存时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点变化,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度降低,1.,管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.,用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,40,四,、,出现肩峰或分叉,1.,样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.,柱塌陷或形成短路通道,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,进样器损坏,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,采用较弱的样品溶剂,3.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换进样器转子,41,五、,鬼峰,1.进样阀剩余峰,2.样品中未知物,3.柱未平衡,4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱),5.水污染(反相),1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.处理样品,3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱),4.每天新配,用抗氧化剂,5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水,42,六、基线噪声,1.气泡(锋利峰),2.污染(随机噪声),3.检测器灯连续噪声,4.电干扰(偶然噪声),5.检测器中有气泡,1.,流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用,HPLC,级试剂,3.,更换氘灯,4.,采用稳压电源,检查干扰的来源,(,如水浴等,),5.,流动相脱气,加柱后背压,43,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.清洁样品,调整流动相,3.加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品,4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,6.连接点降至最低,对所有连接点作适宜调整,尽可能采用细内径的连接管,7.用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,44,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,进样前后排出气泡以降低扩散,3.,设定速率应是每峰大于,10,点,4.,设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的,10%,45,八、,峰展宽,5.流动相粘度过高,6.检测池体积过大,7.保存时间过长,8.柱外体积过大,9.样品过载,5.,增加柱温,采用低粘度流动相,6.,用小体积池,卸下热交换器,7.,等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.,将连接管径和连接管长度降至最小,9.,进小浓度小体积样品,46,谢 谢！,47,