细胞化学与组织化学-课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,组织化学技术,组织化学技术,1,序 言,现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科，它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。,序 言 现代组织化学是介于细胞生物,2,组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。,主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。,组织化学（histochemistry）/细胞化学(cyto,3,一、组织化学发展简史,组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。,一、组织化学发展简史 组织化学是在组织学和化,4,(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。,依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成,酶细胞化学,。,70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。,(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的,5,80年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。,80 90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。,细胞化学与组织化学-课件,6,激光扫描共聚焦显微技术,，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物,(,包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca,2+,和pH值等,),，,流式细胞术,是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数。,激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析,7,二、组织化学技术的基本要求,1尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。必须选择适当的固定液和恰当的处理方法。,2化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物,不移位，不弥散,。,二、组织化学技术的基本要求 1尽可能地保持组织和细胞生前的,8,3反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。,4反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。,5反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。,6反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。,3反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶,9,三、细胞化学技术显示的化学成分：,蛋白质,：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；,RNA和DNA,；,糖类,：如糖原、粘多糖和糖脂等；,脂类,：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；,酶,：包括,水解酶,(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、,氧化酶,(琥珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和,激酶,、,转移酶,等；,生物胺,：5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；,特异抗原,：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；,无机盐和微量元素,：如铁、铜、锌、钴、镁等。,三、细胞化学技术显示的化学成分：蛋白质：显示某些特定蛋白、某,10,四、细胞化学染色的原理：,细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。常用组织化学方法的原理如下：,四、细胞化学染色的原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系,11,一）金属-金属盐沉淀反应原理,利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞化学成份反应过程中生成,有色沉淀,，借以辨认所检查的物质。,如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。,一）金属-金属盐沉淀反应原理利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属,12,二）偶氮偶联法原理,用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶氮色素。,萘基磷酸钠 磷酸氢二钠萘酚,萘酚FAST BLUE 偶氮染料,碱性磷酸酶,水,二）偶氮偶联法原理 用人工合成的酶底物，在酶的作,13,三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理,利用细胞中多糖放出的醛基可将Schiff氏剂中的,无色品红,转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。,这种反应多用于显示细胞中的,糖类,和细胞核内的,DNA,，前者称为,PAS反应,，后者称为,Feulgen反应,。此外，还可用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。,三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理 利用细胞,14,四）联苯胺法原理,过氧化氢酶分解H,2,O,2,产生新生氧，后者可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的,过氧化物酶,。,四）联苯胺法原理 过氧化氢酶分解H2O2产生新,15,五）色素形成法原理,是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。,色素形成法主要包括四唑盐法（NBT、MTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反应用于酯酶、磷酸酶等,五）色素形成法原理 是一组显示酶定位的常用方法,16,六）底物标记法原理,底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。,最常用的底物标记法为放射自显影术，即70年代后兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底物进行捕捉。,六）底物标记法原理底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的,17,七）荧光染色与免疫荧光法原理,荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞中的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。,例如吖啶橙可以同时对细胞内的DNA和RNA染色，细胞核的DNA呈,亮绿色-黄绿色,荧光，胞质和核仁的RNA呈,桔红色,荧光。,七）荧光染色与免疫荧光法原理 荧光染色法是用特定的荧光染料对,18,组织与细胞材料的制备,组织与细胞材料的制备,19,一、组织取材注意事项,1.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。,2.组织块的大小,大小可根据需要而定，一般,长1cm宽1cm厚0.20.3cm。,3.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定。,取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。,一、组织取材注意事项1.注意防止人为因素的影响,20,4.取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材，,脑组织和神经组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。,5.注意包埋方向，,包埋时要平整。,6.保持材料的清洁,7.切除不需要的部分，骨组织需脱钙,8.明确编号，登记,4.取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如,21,培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：,（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（10,6,）涂在包被有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，固定后备用。,胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离心沉淀法收集细胞。,二、细胞材料的准备,培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有：,22,三、组织标本的固定,1.目的,(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态,(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿,三、组织标本的固定 1.目的,23,（3）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构，固定剂兼有硬化作用,（4）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,（3）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构，固定剂兼有,24,2.固定液的种类,固定液分为,单纯固定液,和,混合固定液,两种。,（1）甲醛固定液：,是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%40%，配成固定液的浓度为4%甲醛。配制时取甲醛原液10ml，加双蒸水或缓冲液至100ml，为甲醛固定液（习惯上称为10福尔马林）。,甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH为7.6，可长期保持中性。甲醛固定后，通常需用流水冲洗12 24小时,否则影响染色效果。,2.固定液的种类 固定液分为单纯固定液和混合固定液两,25,(2)4多聚甲醛固定液,(3)Bouins液,苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml,渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为1224小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。,(2)4多聚甲醛固定液,26,（4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml,此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间24小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。,（4）Carnoy氏液 纯酒精,27,(4)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。,(5)Methacarn固定液：甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存备用，对核内抗原的保存效果较好。,(6)丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是一种还原剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。,(4)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定,28,固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,组织固定后必须彻底冲洗。,固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类及浓度、温度而定。原则,29,细胞化学与组织化学-课件,30,