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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,电 泳 技 术,electrophoresis,定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称为,电泳,(electrophoresis),。,许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用于这些物质的分离与鉴定。,F=Q.E,根据,Stoke,氏定律,:,f,6r,（,v,是电泳的,速率,、,r,为微粒的,半径,、,为介质的,粘度系数,),当,F=f,时，即达到动态平衡时：,QE=6r,F,f,E,Q,一、基本原理,E,1.,电泳速率,2.,电泳迁移率（,mobility,）,迁移率,(),指带电微粒在单位电场强度下的电泳速率。,二、影响,电泳的因素,内在因素,外界因素,被分离物质的带,电荷量,分子质量,大小,带电物质的颗粒,形状,影响电泳,的内在因素,带电荷量越多，电泳速率越快；反之，则越慢。,带电荷量大小的影响,带电物质的颗粒形状影响,球状分子摩擦阻力小，,电泳,速率大；,纤维状分子摩擦阻力大，,电泳,速率小。,分子质量大小的影响,分子质量越,大的，,电泳,速率慢；,分子质量越,小的，,电泳,速率快。,影响电泳的外界因素,电泳介质的,PH,值,缓冲液的离子强度,电场强度,电渗现象,支持介质的筛孔,电泳介质的,PH,电泳介质的,PH,值决定带电物质的,解离程度,，也决定物质,所带净电荷,的多少。,pH,值离,pI,越远,，带电荷,越多,，速率越,快,；反之，则越慢。,分离蛋白质混合物时，选择,扩大,各种蛋白质所,带电荷量差别,的,pH,值。,缓冲液：常见缓冲液如磷酸盐、醋酸盐、巴比妥盐、,Tris,-EDTA,缓冲液等。,缓冲液,的离子强度：,离子强度（,I,）,是指溶液中各种离子的摩尔浓度与其价数平方乘积总和的,1,/,2,。,I=1/2 CiZi,离子强度,增加,，带电颗粒吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成与符号相反的离子氛，,降低,Q,；且介质,黏度增大，阻力增大,，影响泳动,。,离子强度,降低,，样品,扩散严重,，分辨率明显降低，缓冲液,缓冲能力减弱,，溶液,PH,稳定性降低,。,综上所述，缓冲液离子强度一般在,0.050.20mol/L,为适。,电场强度,(electric field intensity),电场强度与电泳速率成,正比,增大电场强度会引起通过介质的,电流,增加，从而导致电泳过程中的,热量增大，,对电泳分离造成多种影响。,冷却装置：高压电泳（,5001000V,或是更高）,电渗现象（,electroosmosis,）,电渗,:,在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动。,原因：,支持物中含可电离的基团,电渗与电泳往往同时存在，,所以带电颗粒的移动距离也受电渗影响,。,支持介质的,筛孔影响,筛孔,大,：泳动速率,快,筛孔,小,：泳动速率,慢,三、电泳仪器设备,电泳槽,盘状电泳槽,垂直板电泳槽,水平电泳槽,电源（电泳仪）,四、电泳的分类,显微电泳,自由界面电泳,区带电泳,区带电泳,类型,按支持物的,物质形状,分：纸、粉末、凝胶电泳等,按支持物的,装置形式,分：平板、垂直、柱状电泳等,按,pH,的连续性,不同分：连续与不连续电泳,按,用途,不同分：分析、制备、定量免疫电泳等,按,电压,不同分：低压、高压、超高压电泳,五、常见电泳,（一）醋酸纤维薄膜电泳,（,cellulose acetate film,）,1,、,支持物,：醋酸纤维薄膜,2,、,特点,：简单、区带整齐、电泳时间短、费用低,3,、,应用,：血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、同工酶的分离及免疫电泳,（二）琼脂糖凝胶电泳,1,、,支持物,：琼脂糖，是从琼脂中提取的一种多糖，是一种天然聚合的长链状分子，沸水中溶解，,45,度开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小取决于琼脂糖浓度。,2,、,特点,：电渗较小、可根据需要调节凝胶孔径。,3,、,应用,：免疫复合物、,核酸分离及纯化,、同工酶分离等。,1,、聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的,三维网状结构,物质。,丙烯酰胺（,Acr,）,交联剂 （,Bis,）,（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（,Polyacrylamide,gel,elec-trophoresis,，,PAGE,）,特点,：机械强度好、热稳定、无电渗、凝胶孔径大小可调节、所需样品少、分辨率高等；,未聚合,的凝胶,有毒性,。,应用,：广泛应用于,蛋白质、核酸、多肽、酶的分离。,2.,不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理：,浓缩效应、电荷效应、分子筛效应,浓缩胶,分离胶,低电导区,被压缩的样品,离心分离技术,Centrifuge Technique,离心分离技术,（,Centrifuge Technique,）,指利用电动离心机产生的离心力，对混合溶液进行,分离和沉淀,的一种技术方法。,从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于,颗粒非常细小的物质,，依靠自然沉降是不能达到完全分离的，只能通过,离心作用,才能使它们沉降下来。,一、离心沉淀的原理,在重力作用下，受到下沉的力为,F,，则：,F=,重力,-,浮力,=,V,g,g,V,排,=,V,g,（,-,）,V,表示颗粒体积，,表示颗粒的密度，,表示液体的密度，,g,表示重力加速度,颗粒受液体给予的向心力为：,Vr,2,维持颗粒作圆周运动所需的向心力为：,Vr,2,向心力差值为：,V r,2,(-),当,时，颗粒受到的向心力不足以维持它在圆周上的运动，因此它将沿,离心管外移,。,V r,2,(-),的值愈大，外移速度愈快。,比较,V,g,（,-,）,与,V,r,2,(-),可见,r,2,相当于,g,，故增加离心机转速，可使,r,2,值比,g,值大许多倍，从而加快颗粒的沉降速度，离心机就是根据这一原理设计制作的。,二、沉降系数,（,sedimentation coefficient,S,）,沉降系数是,生物大分子,的特征常数，,是指单位离心力作用下颗粒的沉降速度。与颗粒密度、形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都有关系。,20,，以水为介质的条件下，测得,S,值为标准状态下的,S,值。,1S=10,-13,秒,三、相对离心力,一般低速离心，转速以,r/min,(revolution,per minute,rpm),表示；高速或超速离心，转速以,相对离心力,表示，真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。,相对离心力（,relative centrifugal force,，,RCF,，,F,R,）,是指在离心力场的作用下，颗粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位是,重力加速度,g,（,9.8m/s,2,）,。,四、离心机的分类,按转速（每分钟转数，,revolution,perminute,，,rpm,）不同可将离心机分为三类：,普通离心机,：转速一般不超过,10,，,000rpm,，用于收集易沉淀的,大颗粒,；,高速离心机,：转速一般不超过,30,000rpm,，用于分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；,超速离心机,：转速可达,120,000rpm,，,分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等；测定样品纯度、沉降系数、相对分子量。,外摆式 角式 固定式,离心机的转头,五、普通离心机的使用方法,检查,外套管是否完整不漏,装液,离心管,2/3,体积为宜,平衡,转头对称位置上离心管,+,外套管,重量相等,置管,对称放置,（两两平衡,原则）,启动,设定离心,时间,及,转速,清洗,清洗离心管，清洁离心机，倒置外套管使其干燥,1.,操作步骤,Eppendorf,管放置、重量的平衡,离心机,2.,注意事项,工作转速在允许范围内。,严格平衡,，每只离心管内的溶液量应相同，对称放置。,加盖，防止离心管飞出伤人。,发现异常立即关机,。,离心管盛液,不宜过满,，避免腐蚀性液体溅出腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。,
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