生物质谱技术与方法全解课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质谱技术与方法,质谱技术与方法,1,质谱分析法,（mass spectrometry，MS）,是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比,（,m/z,）的不同进行分离，来进行成分和结,构分析的,方法。,所得结果用质谱图（亦称质谱，,Mass,Spectrum,）表示。,根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无,机物的定性和定量分析、生物大分子的结构,分析、样品中各种同位素比的测定及固体表,面的结构和组成分析等。,质谱分析法（mass spectrometry，MS）是将化,2,生物质谱,（,Bio-mass spectrometry,，,Bio-MS,）,是用于生物分子分析的质谱技术。,生物质谱要求测定上万甚至是几十万的,相对分子质量。,随着电喷雾电离（,ESI,）和基质辅助激光,解吸电离（,MALDI,）技术的完善和成熟，,生物大,分子的质谱分析才得以实现。,生物质谱（Bio-mass spectrometry，B,3,The Nobel Prize in Chemistry 2002,for the development of methods for identification and,structure analyses of biological macromolecules,for their development of soft,desorption ionisation methods for,mass spectrometric analyses of,biological macromolecules,for his,development of,nuclear magnetic,resonance,spectroscopy for,determining the,three-dimensional,structure of,biological,macromolecules in,solution,约翰,芬,田中耕一,库尔特,伍斯里,奇,The Nobel Prize in Chemistry,4,质谱法的基本原理,质谱分析的基本过程是使样品在离子源中,发生电离，生成不同质荷比的带电离子，,经加速电场的作用形成离子束，进入质量,分析器，在其中再利用电场和磁场使其发,生色散、聚焦，获得质谱图。,质谱法的基本原理质谱分析的基本过程是使样品在离子源中,5,质谱分析中，多种离子化技术均可使物质,分子失去外层价电子形成分子离子,（,molecular ion,，,M,+,），分子离子中的化,学键还可以继,续发生某些有规律的断裂而,形成不同质量的碎片离子（,fragment ion,）：,M,M,+,+,碎片离子,+中性分子,质谱分析中，多种离子化技术均可使物质（molecular i,6,被分析样品离子电离后经加速进入磁场时，其动,能与加速电压及电荷,z,有关，即：,zeU=1/2mv,2,其中：,z,为电荷数，,e,为元电荷（,e=1,60,10,-19,C,），,U,为加速电压，,m,为离子的质量，,v为离子初,加速后的运动速度。,具有速度,v,的带电粒,子进入质谱仪的质量分析器中，,根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比,（,m,z）的不同实现分离。,被分析样品离子电离后经加速进入磁场时，其动zeU=1/2,7,质谱仪,质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器,和检测系统。为了获得离子的良好分析，必须,避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在,和通过的地方，必须处于真空状态。,在进行质谱分析时，一般过程是：通过合适的,进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样,品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过,适当的加速后进入质量分析器，按不同的,m,z,进行分离。然后到达检测器，产生不同的信号,而进行分析。,质谱仪质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器在进行质谱分析,8,质量分析器,检测器,样品导,入系统,离子源,真空泵,m/z,计算机控制与,数据处理,相,对,丰,度,质谱仪的构成,质量分析器检测器样品导离子源真空泵m/z计算机控制与相质谱仪,9,Data,System,Mass,spectrum,out,Inlet,System,Mass,Analyzer,Ion,Source,Detector,Sample,in,Inlet systems:,Ion sources:,Mass analyzers:,Simple vacuum lock,HPLC,GC,Electrospray(ESI),MALDI,FAB/LSIMS,Electron ionization(EI),Quadrupole,Time-of-flight,Ion trap,Magnetic sector,FTMS,Mass Spectrometer Schematic,Vacuum envelope,DataSystemInletMassIonDete,10,离子源,(ion source),质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子,源,(ion source),。由于离子化所需要的能量,随分子不同差异很,大，因此，对于不同的分,子应选择不同的离解方法。,通常将能给样品较大能量、生成较多碎片离,子的电离方法称为,硬电离方法,（如电子轰击,离子化，,EI），而给样品较小能量、,碎片离,子较少或不生成碎片离子的电离方法称为,软,电离方法,。,离子源(ion source)质谱仪中将分子转化为离子的装置,11,生物质谱中有代表性的离子源,1,电喷雾电离,(,E,lectrospray Ionization,，,ESI,),2,离子喷雾电离（,Ion spray Ionizat,ion,，,ISI,）,3,大气压化学电离,(,Atmospheric Pre,ssure,Chemical Ionization,，,APCI,),4,基质辅助激光解吸电离,(,M,atrix Assisted,Laser Desorption Ionization,，,MALDI,),5,快原子轰击电离,(,Fast Atom Bonbardment,Ionization,，,FAB,),生物质谱中有代表性的离子源1电喷雾电离(Electrosp,12,离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源,看作是离子化反应器，样品在其中发生,一系列的特征裂解反应，反应在很短时,间（,10,-11,s,）内发生，所以可以快速地获,得质谱图。,离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源,13,质量分析器,质量分析器是质谱仪的核心，它将离子,源产生的离子按其质量和电荷比（质荷,比,m/z,，,m,离子的质量数，,z离子携,带的电荷数）的不同在空间的位置,时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按质荷比（,m/,z,）大小顺序排列,而成的,质谱图。,质量分析器质量分析器是质谱仪的核心，它将离子,14,质量分析器,(mass analyzer),的种类,1.,磁质量分析器,(,单聚焦质量分析器,双聚,焦质量分析器,),2.,四极质量分析器,(,四极杆滤质器,),3.,飞行时间质量分析器,(TOF,),4.,离子阱,(Ion Tra,p),质量分析器,5.,离子回旋共振,质量分析器,其中,234,是目前生物质谱,分析中常,用的质量分析器,质量分析器(mass analyzer)的种类1.磁质量分析,15,检测器,1.,直接电检测器,2.,电子倍增器,3.,闪烁检测器,4.,微通道板,检测器1.直接电检测器,16,计算机控制与数据处理系统,1.,监控各单元的工作状态,实现质谱仪的,全自动操作,.,2.,数据的采集和简化,.,3.,质量数的转换,.,4.,扣除本底或相邻组分的干扰,.,5.,谱峰强度归一化,.,6.,标出高分辨质谱的元素组成,.,计算机控制与数据处理系统1.监控各单元的工作状态,实现质谱仪,17,7.,用总离子流对质谱峰强度进行修正,.,8.,谱图的累加,平均,.,9.,输出质量色谱图,.,10.,单离子检测和多离子检测,.,11.,谱图检索,.,7.用总离子流对质谱峰强度进行修正.10.单离子检测和多离子,18,质谱图,质谱分析中，按各离子,m/z,的顺序及相对,强度大,小记录分析结果的图谱即为质谱,图。由于图谱中离子的质量及相对强度,是各物质所特有的，即反映了物质的性,质和结构特点，因此通过质谱解析可以,进行物质的成分和结构分析。,常见的质谱图是经过计算机处理后得到,的棒图（,bar graph,）。,质谱图质谱分析中，按各离子m/z的顺序及相对常见的质谱图是经,19,常见的质谱图是经计算机,处理的棒图,.,图中,纵坐,标表示离子的,相对丰度,(,以质谱中最强,峰的高度为,100%,并将此,峰称位基峰,其余峰按与,基峰的比例加以表示,又,称为相对强度,);,横坐标表,示离子的质荷比,.,根据峰位,(,棒位,)可进行定,性鉴别,;,根据相,对丰度可,进行定量测定,.,15,28,29,31(,基峰,),32,(,分子离子峰,),33,100,80,60,40,20,10,20,30,40,50,m/z,相,对,峰,强,棒图,(bar graph),CH,3,OH,常见的质谱图是经计算机图中,纵坐标表示离子的基峰的比例加以表,20,生物质谱技术与方法全解课件,21,%Intensity,1239.4,1679.8,2120.2,2560.6,Mass(,m/z,),0,3001.0,0,799.0,10,20,30,100,1480.60,1567.46,90,80,70,60,50,40,804.68,2044.21,1738.35,1570.45,1439.65,1894.26 2047.21,927.77,843.87,2470.78,2210.10,1923.27,1724.38,1000.70,1209.84,1391.67,1574.12,2661.87 2807.67,2066.13,牛血清蛋白（,BSP,）酶解产物的质谱图,Voyager Spec#1BP=1480.6,8127,%Intensity1239.41679.82120.225,22,10,0,30,%Int.,100,90,80,70,60,50,40,3494,3495,3496,3497,3498,3499,3500,3501,3502,3503,3497.6422,3496.6541,3498.6256,3495.6545,3499.6528,20,3500.6595,3501.6502,Resolution 20,000,m/z,胰岛素的高分辨质谱图,1030%Int.349434953496349734983,23,质谱仪的主要性能指标,衡量质谱仪整体性能的主要指标有：,质量范围,分辨率,质量准确度,灵敏度,扫描速度等,质谱仪的主要性能指标衡量质谱仪整体性能的主要指标有：质量准确,24,质量,分析器,质量上限,(m/z),质量准确,度（u）,分辨率,（R）,扫描速度,（u/s）,适用,范围,四极杆质,谱,4000,0.1,500,3000,4000,6000,小分子、,多电荷离,子大分子,离子阱质,谱,10000,0.1,1000,10000,4000,6000,小分子、,多电荷离,子大分子,飞行时间,质谱,500000,0.001(高,分辨飞行,时间质谱),500,1000,（低），,2000,20000,（高）,1000000,小分子、,大分子,不同类型质量分析器的性能指标,质量质量上限质量准确分辨率扫描速度适用四极杆质40000,25,质量范围,(mass range),是指质谱仪能够测量的离子质量范围，通常用最小和最大离,子的离子质量表示。,质谱分析中，是以核素,12,C,质量（,12,C=12.000u,）的,1/12为一,个质量单位（u）。,1u=,（,12.00,000 gmol,-1,/6