核酸的分离与纯化课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸的分离与纯化,Chapter 2,Chaptor 2 核酸的分离与纯化,就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。,核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,核酸的分类,DNA,主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量,DNA,，,如线粒体,DNA,（,mtDNA,），,叶绿体,DNA,（,cpDNA,），,质粒,DNA,。,RNA,存在于细胞质中，如,mRNA,rRNA,tRNA,等。,除上述,DNA,，,RNA,外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含,DNA,，,或只含有,RNA,。,核酸制备的一般原则,分离纯化核酸总的原则：,应保证核酸一级结构的完整性；,排除其它分子的污染。,核酸纯化应达到的要求：,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其它生物大分子的污染应降低到最低程度；,排除其它核酸分子的污染。,核酸制备的一般原则,核酸制备时应注意的事项,:,尽量简化操作步骤，缩短提取过程。,减少化学因素对核酸的降解。,PH4-10,减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温,防止核酸的生物降解。,核酸制备的一般原则,核酸制备的步骤：,破碎细胞,提取,纯化,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,降低温度，改变,pH,及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。,对于,DNA,，,抑制,DNase,活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。,对于,RNA,，,因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制,RNase,活力较难，故在,RNA,提取中设法抑制,RNase,更重要。,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,DNase,抑制,加入少量金属离子螯合剂，如,0.01E DTA mol/L,或柠檬酸钠，,DNase,基本可以全 部失活。,去垢剂、蛋白变性剂及,DNase,抑制剂,也可使,DNase,失活。,核酸制备的一般方法和原理,核酸酶的抑制和抑制剂剂,RNase,抑制,操作要带手套。,所有器皿要严格消毒，,试剂处理,低温操作,在分离过程中要加入一定的,RNase,抑制剂。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的去垢剂,核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：,1,溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；,2,溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；,3,对,RNase,、,DNase,有一定的抑制作用。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的去垢剂,SDS,脱氧胆酸钠,4-,氨基水杨酸钠,萘,-1.5-,二磺酸钠,三异丙基萘磺酸钠,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,蛋白质变性剂的作用：,1.,使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。,2.,使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。,3.,某些蛋白质变性剂也有抑制,RNase,活性和破裂细胞的作用。,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,苯酚,氯仿,盐酸胍,DEPC,核酸制备的一般方法和原理,核酸制备中常用的酶制剂,DNase,RNase,蛋白酶,K,溶菌酶,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的一般过程,破碎细胞（防止核酸酶的作用）,微生物：溶菌酶、,SDS,裂解。,高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。,酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，,冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。,动物：液氮处理后用匀浆器破碎。,细胞器,DNA,，,首先纯化细胞器。,以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的,一般过程,破碎,抽提核酸除去杂质,1,首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离,2,使核酸与蛋白质分离,3,除去脂类,4,多糖的除去,核酸制备的一般方法和原理,核酸提取的,一般过程,核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂,(,盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是,温度,和,介质,温度：,4（5）最佳和最简单,-70是长期保存的良好温度，为一次,性保存,-20保存（冰箱的自动化霜装置）,保存介质：,TE缓冲溶液,(最常用),10mmol/L Tris-Cl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,