蛋白质组学课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学 第二章 染色体与基因,厚德 博学 精诚 济世,分子生物学 第三章 人类基因组计划,Proteome&Proteomics,Proteome&Proteomics,1,Proteome&Proteomics 定义,Proteome：,1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“,蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质,”(proteome indicates the proteins expressed by a genome),“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成,蛋白质组(Proteome):,细胞内的全部蛋白质,Proteome&Proteomics 定义Proteo,2,Proteomics定义,蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学,最早是在1995年提出的，它在,本质,上指的是在,大规模水平上,研究蛋白质特征：,表达水平（量）,翻译后的修饰（成熟与调控）,蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识,Proteomics定义蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研,3,Proteome 与 Genome关系,互补的角度/空间来研究细胞的分子架构,相辅相成,Genome-导演,RNome-编剧,Proteome-演员,Proteome 与 Genome关系互补的角度/空间来研究,4,Proteome 与 Genome区别,稳定性,Proteome-静态,Genome-动态,修饰化程度,Proteome-高,Genome-底,复杂程度,Proteome-高（20aa +高度多样性修饰）,Genome-底（4nt）,特异性,Proteome-组织和细胞特异性,Genome-无组织和细胞特异性,Proteome 与 Genome区别稳定性,5,功能蛋白质组(functional proteome),1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在,特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质,。,功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分,，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。,功能蛋白质组(functional proteome)199,6,功能蛋白质组,功能蛋白质组,7,蛋白质组学研究思路与方法,策略、技术、工具,蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具,8,蛋白质组研究相关网站,蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术,http:/www.proteomeworks.bio-,蛋白质组研究技术、信息等,http:/,发现新蛋白及新作用(新药开发),http:/www.proteome.med.umich.edu,蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等,http:/www.proteome.co.uk,各种蛋白质组研究相关信息,http:/www.micromass.co.uk,介绍蛋白质鉴定的先进仪器,http:/www.expasy.ch,蛋白质鉴定专家系统,，Swiss Institute of Bioinformatics,http:/expasy.proteome.org.au,蛋白质鉴定专家系统,，Australian Proteome Analysis Facility,http:/expasy.cbr.nrc.ca,蛋白质鉴定专家系统,，Canadian Bioinformatics Resours,蛋白质组研究相关网站蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术,9,主要专业术语及其英文对照和缩写,IPG-IEF：,固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing,）,SDS-PAGE：,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（,Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,）,2-DE：,双向电泳,(Two Dimensional Electrophoresis,),HPLC：,高效液相色谱（,High performance Liquid Chromatography,）,MALDI,-,TOF,MS：,基质辅助激光解吸电离,飞行时间,质谱（,Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization,Time-of-Flight,Mass Spectrometry,),主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等,10,研究策略与技术,两条互补的实验流程,基于凝胶的工作流程,（Gel-based workflow）,基于液相色谱的工作流程,（LC-based workflow）,研究策略与技术两条互补的实验流程,11,蛋白质组学实验室所需的条件,蛋白质组学实验室所需的条件,12,双向凝胶电泳（2DE）,是,等电聚焦电泳,和,SDS-PAGE,的组合,即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）,然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）,凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图,双向凝胶电泳（2DE）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,13,蛋白质组研究的基本技术,2D-SDS-PAGE：,样品制备,第一向IPG-IEF电泳,IPG平衡,第二向SDS-PAGE电泳,染色（银染）及 图谱分析,目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）,蛋白质组研究的基本技术2D-SDS-PAGE：,14,2DE结果图谱,2DE结果图谱,15,蛋白质组研究的基本技术-样品预分离,样品的制备（预处理）,：,组织,细胞,细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）,蛋白质组研究的基本技术-样品预分离样品的制备（预处理）,16,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,重要性：,在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补,把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的,实体,原则：,使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态,防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀,防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）,完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取重要性：,17,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,步骤：,破碎,沉淀蛋白,去除杂质,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取步骤：,18,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,样品制备流程-破碎,尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则,机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法）,化学法（去污剂法、酶裂解法）,物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透法、玻璃珠破碎法）,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取样品制备流程-,19,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,样品制备流程-沉淀蛋白,去杂浓缩后蛋白可溶性是关键,TCA-丙酮沉淀法,三氯醋酸（TCA）沉淀法 引起降解/修饰,丙酮沉淀法,硫酸铵沉淀法 影响IEF,醋酸铵沉淀法 步骤繁琐,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取样品制备流程-,20,2D电泳结果影响因素分析,2D电泳结果影响因素分析,21,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,样品制备流程-去除杂质,关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰,核酸的清除（DNase/Rnase）,多糖的清除（超离心、TCA沉淀等）,去污剂的清除（丙酮沉淀法等）,盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取样品制备流程-,22,2D电泳结果影响因素分析,可能原因：样品含高丰度Pr,可能原因：TCA残留致使Pr丢失,2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：,23,2D电泳结果影响因素分析,可能原因：Tris质量不好,可能原因：Urea 不纯,2D电泳结果影响因素分析可能原因：Tris质量不好可能原因：,24,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取,样品制备注意事项：,蛋白质水解-蛋白酶抑制剂(PMSF等),特殊样品的制备(低丰度、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量),样品定量,重复性,蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取样品制备注意事项：,25,2D-SDS-PAGE重复性,The same protocol and sample,however not the same results,Rec:similar;cir:different,2D-SDS-PAGE重复性The same protoco,26,2-DE,第一向,IPG-IEF电泳,IEF是一种根据样品的,等电点不同,而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带,从而得知其等电点信息,2-DE第一向IPG-IEF电泳,27,IEF,的基本条件,step 1,step 2,step 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,step 1,step 2,step 3,total,total,step 1,step 2,step 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,IEF的基本条件step 1step 2step 3tota,28,IPG-IEF电泳,IPG-IEF电泳,29,2-DE,第二向垂直,SDS-PAGE电泳,聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，,电泳速度仅与分子量有关,从而得知其分子量信息,2-DE第二向垂直SDS-PAGE电泳,30,第二向垂直,SDS-PAGE电泳,凝胶浓度与其对应的分离范围,胶浓度 分离范围(KD),5%36-200,7.5%24-200,10%14-200,12.5%14-100,15%14-60,第二向垂直SDS-PAGE电泳凝胶浓度与其对应的分离范围,31,第二向垂直,SDS-PAGE电泳,步骤：,溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED),灌胶,电泳,Ettan Dalt twelve电泳系统,第二向垂直SDS-PAGE电泳步骤：Ettan Dalt t,32,第二向垂直,SDS-PAGE电泳,Ettan Dalt six电泳系统,第二向垂直SDS-PAGE电泳Ettan Dalt six电,33,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,染色：,1）考马斯亮兰染色法；,2）银染法；,3）负染法；,4）荧光染色法；,5）放射性同位素标记法等,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测染色：,34,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,图像扫描和分析Image Scanner II,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析Image,35,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（Ettan,36,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,质谱或MALDI-TOF MS,质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同,荷质比,的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生