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Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 荧光(ynggung)分光光度法,第一页，共21页。,基本(jbn)要求：,了解荧光光谱法的基本(jbn)原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。,第二页，共21页。,第一节 概论(giln),回顾(hug)：,四大(s d)类,电化学分析法,光学分析法,色谱分析法,其它分析方法,原子光谱法,分子光谱法,X,射线光谱法,核磁波谱法,紫外,-,可见光分光光度法,荧光分光光度法,红外吸收光谱法,拉曼光谱法,第三页，共21页。,一、应用(yngyng)：,1.定量分析 能产生荧光,或能形成荧光配合物的物质(wzh)。,2.简单定性 回答“是不是”。,二、特点(tdin)：,灵敏度高，比吸收光谱法高1010,4,倍。,ppb,选择性比吸收光谱法好。,第四页，共21页。,第二节,基本原理,一、分子荧光的产生,物质(wzh)吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量以热能的形式。以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。,荧光,磷光,无辐射跃迁,激发态,亚稳态（三重态）,基态,第五页，共21页。,最常见的光致发光：荧光和磷光(ln un)。,两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-910-6秒，磷光(ln un)寿命10-310秒。,荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。,由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。,第六页，共21页。,二、激发光谱和发射光谱(f sh un p),激发光谱,固定(gdng)荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。,300,350,400,(nm),F,【例】硫酸奎宁（0.1,mol/L,硫酸溶液）的激发光谱。,第七页，共21页。,发射光谱,固定(gdng)激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。,300,350,400,(nm),F,【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。,第八页，共21页。,三、分子荧光与分子结构(fn z ji u)的关系,分子要产生(chnshng)荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。,能产生荧光(ynggung)的分子具有的结构特点：,共轭双键,刚性平面,多环结构,【例】,芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。,第九页，共21页。,四、荧光(ynggung)强度与浓度的关系,：量子效率，发射光量子与吸收(xshu)光量子之比。,I0：入射光强度,：摩尔吸光系数,b：光程,c：浓度,0,bc,公式成立前提条件：,即：当试样浓度较低时（），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子(fnz)碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）,第十页，共21页。,：量子效率，发射光量子与吸收(xshu)光量子之比。,能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。,由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测(jin c)器。,测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5,物质(wzh)吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量以热能的形式。,回顾(hug)：,第一节 概论(giln),一、应用(yngyng)：,由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。,特点：1 光源方向与检测(jin c)方向成直角；,一、基本(jbn)结构示意图,1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。,选择性好，与能产生(chnshng)荧光的物质少有关。,可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。,所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当(shdng)范围内。,简单定性 回答“是不是”。,第三节 荧光(ynggung)分光光度计,一、基本(jbn)结构示意图,特点：1 光源方向与检测(jin c)方向成直角；,2 二个单色器。,显示器,检测器,荧光单色器,样品池,激发光单色器,光源,第十一页，共21页。,二、主要部件(bjin)及功能,1光源,高压汞蒸气(zhn q)灯，氙灯。,能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。,2激发光单色器,作用：提供单波长的激发光。,色散元件：棱镜或光栅。,出射狭缝宽度可调。,第十二页，共21页。,3样品池,须用石英材料制成。,4荧光单色器,将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。,出射狭缝宽度可调。,5检测(jin c)器,光电转换元件，测定荧光的强度。,检测(jin c)方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。,由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测(jin c)器。,第十三页，共21页。,第四节 定量分析(dnglingfnx),一、定量方法,一般采用工作(gngzu)直线法。作CF直线。,F,C,第十四页，共21页。,配制一系列待测成分(chng fn)的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5,测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5,建立工作直线（F C）,作图法,回归法,测量待测样品，得F样,从工作直线上找到待测成分(chng fn)的浓度C样,由回归方程计算出C样,第十五页，共21页。,二、影响荧光强度测定(cdng)的因素,1激发光照射,有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解(fnji)而导致F。,所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在,测定时才打开光闸让激发光照射样品池。,2温度,温度，荧光效率下降，F。（因为，温度，增加分子间,碰撞机会而使能量消耗掉。）,第十六页，共21页。,4溶剂,有些溶剂会使荧光(ynggung)效率下降，也可能带来干扰荧光(ynggung)。,苯胺,pH7,12,时，发兰色荧光。,pH2,或,PH13,时，无荧光。,【例】,所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当(shdng)范围内。,3pH值,pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而(cng r)影响荧光强度。,第十七页，共21页。,灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。,选择性好，与能产生(chnshng)荧光的物质少有关。,三、定量分析(dnglingfnx)的特点及应用,第十八页，共21页。,思考题,一、概念,（荧光(ynggung)）激发光谱,（荧光(ynggung)）发射光谱,第十九页，共21页。,二、问答题,试述分子荧光产生的过程。,试述分子荧光强度与浓度(nngd)的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。,分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。,为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？,第二十页，共21页。,荧光分析的激发光谱和发射光谱分别(fnbi)提供了哪些定量分析信息？核黄素的激发光谱（实线）和发射光谱（虚线）如图所示，对核黄素进行荧光定量分析时，最佳的激发光波长和荧光波长各为多少？为什么？,第二十一页，共21页。,
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