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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一、概念,1,、定义,酶工程亦称酶工艺，是在生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化为有用物质的技术 酶工程与发酵工程密切相关，是发酵工业发展的产物，是酶学原理与化工技术相结合而形成的一门理论性很强的应用技术。主要内容包括各种酶的开发、生产和利用，酶的分离、纯化技术、酶的化学修饰技术，固定化技术，酶反应器的研制和应用等。,酶是生物催化剂，是生物体产生的具有活性的蛋白质。它可高效、专一地催化特定的生化反应，酶的催化作用可使反应速度提高,10,的,8,次到,10,的,20,次倍。酶促反应具有反应条件温和、能耗低、污染小、操作简单等优点。,二、酶的探索与发现：,1,、史前时期,距今,4000,多年前龙山文化时期，,利用天然酵母酿酒。,公元前,12,世纪,制饴、制酱。,书经,记载“若作酒軆，尔惟曲孽”。,“曲”：长霉菌的谷物；“孽”：谷芽。,左传,用“曲”、“孽”治病。,2,、,近代发展,1833-1835,年,淀粉的第一次酶解法国化学家,Anselme Payen,和,ean-Franois Persoz,描述了从大麦的麦芽中分离淀粉酶多聚体的过程，并将之命名为淀粉酶。,1836,年,德国生理学家,Theodor Schwann,在研究消化过程时，分离出一种在胃内消化蛋白的物质，将它命名为胃蛋白酶。这是第一个从动物组织中提取到的酶。,1883,年,Johan Kjeldahl,建立了一套检测有机物中,-3,价氮的方法，即测定氮的含量的方法。,1894,年,加酶食品的第一次商业化生产,1894-1913,年,德国化学家,Emil Fisher,根据糖化酶的特点建立了钥匙,-,锁理论。,1926,年,科学家发现酶是蛋白质,1953-1958,年,Watson,和,Crick,发现,DNA,是双螺旋结构,1963,年,碱性蛋白酶,-,洗涤剂用酶的突破,1965-1974,年,淀粉工业的重大突破随着一种可以将淀粉分解成糖的，不含转葡萄糖苷酶的葡萄糖淀粉酶上市，微生物酶类应用于食品工业的首次重大突破于,20,世纪,60,年代发生。,从,20,世纪,50,年代初开始，酶及产酶细胞的固定化技术在生产实践中得到迅速发展，引起食品、发酵工业一场大变革。,美国,20,世纪,70,年代初开始，使玉米淀粉经酶法液化、糖化和异构化并采用固定化技术，工业化生产第一代、第二代和第三代高果糖浆，代替蔗糖作为可口可乐、百事可乐等饮料食品的甜味剂。,1982,年美国,Cech,研究组发现,RNA,分子中含有一个具有自身切接功能的片断，称为内含子，这种具有催化功能的,RNA,称为核酸类酶。,至目前为止，已发现自然界存在的酶有,3000,多种，但真正形成工业规模生产的只有几十种。,3,、现代酶学发展,70,年代初实现,DNA,重组技术或称克隆技术，促使酶学研究进入新的发展阶段。,“工具酶”基因工程中所应用的系列酶的总称。,到目前为止，在基因工程中应用的工具酶已有,500,多种。,目前已有,100,多种酶基因克隆成功。,凝乳酶过去从小牛胃中提取，每年大约宰杀,500,万头小牛。,重组凝乳酶：,DNA,重组技术,第二节 酶的生产和利用,一、微生物酶制剂的生产,酶制剂的大规模工业生产始于第二次世界大战后，随着抗生素工业的发展而建立。,国际市场,1983,年酶制剂产量,6.5,万吨,销售额,4,亿美元,20,世纪,90,年代初,销售额,10,多亿美元,90,年代末,销售额,20,多亿美元,（一）发酵法生产食品级酶要求：安全和卫生,菌种严格控制、原料要求、防止有害物质的污染、选择合理的提取工艺。,（二）生产步骤：,1,、目的酶生产菌株的分离筛选,（,1,）从自然界分离筛选,（,2,）用物理、化学因子处理诱变,（,3,）用基因重组或细胞融合技术选育,2,、酶的生产,（,1,）要选择好的培养方法，包括培养基组成配比、培养温度、,pH,值、通气量等。,(,图,:,微生物在相当于三层楼高的发酵罐里生长繁殖，产生所需的酶,),美国20世纪70年代初开始，使玉米淀粉经酶法液化、糖化和异构化并采用固定化技术，工业化生产第一代、第二代和第三代高果糖浆，代替蔗糖作为可口可乐、百事可乐等饮料食品的甜味剂。,酶催化反应：在均相或非均相系统中由酶参与的将底物转变为产物的过程。,“工具酶”基因工程中所应用的系列酶的总称。,酶工程在食品工业中的应用,分离鱼碎肉废水中油和蛋白质,干酪生产：将牛奶用乳酸菌发酵制成酸奶，然后加凝乳酶水解K-酪蛋白，在酸性条件下，钙离子使酪蛋白凝固，再经切块加热压榨熟化而成。,半纤维素（高分子）半纤维素（低分子）,1883年,Johan Kjeldahl建立了一套检测有机物中-3价氮的方法，即测定氮的含量的方法。,但在果汁加工上，却造成了压榨、澄清的因难。,（2）可进行多酶反应；,如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。,白酒生产中采用糖化酶代替麸曲可使出酒率提高2%7%，这既能节约粮食，又可简化设备，节省厂房。,2、制取工业酶制剂的步骤：,4、酶用于肉类和鱼类加工,常用的交联剂有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺或乙烯双马来亚胺（形成重氮盐）。,乳糖是一种缺乏甜味且溶解度很低的双糖，难于消化。,固定化酶反应器非均相,全世界生产干酪所耗牛奶达1亿多吨，占牛奶总产量的1/4。,丙酸 氨基酸 内酯,（3）用基因重组或细胞融合技术选育,（,2,）,确定工业规模大量生产的一系列工程和工艺条件，以及培养罐的形式、大小、通气条件、温度和,pH,值的控制等。,(,图：通过改变培养基类型、酸碱度、氧气浓度和温度，研究人员现了生产某种酶的微生物的最佳生长条件。,),二、酶的提取、分离和纯化,1,、微生物酶制剂的工业提取步骤大致如下,：,如果是胞内酶，则首先要分离收集其菌体，使之破碎，将酶提取至液相中，此为出发酶液；,如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。,2,、制取工业酶制剂的步骤：,第一步,除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清酶液，必要时再进行减压浓缩；,第二步,根据质量要求和经济性采用适当方法（如用盐析法、有机溶剂沉淀法、丹宁沉淀法等）将酶沉淀分离；,(,图：只有酶和水能通过转鼓式过滤机；培养基和微生物则被留在硅藻土上。,),第三步,收集沉淀、干燥、研粉、加适当的稳定剂、填充剂、做成粉末制剂。,酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成,0.5mm,大小的粒状物。然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。,(,图,:,用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。,),3,、,其他方法,对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。常用的方法有：,（,1,）蛋白质选择性变性法,（,2,）分级盐析法,有机溶剂分级沉淀法,等电点法,柱层析法,电泳法,亲和层析法,三、酶的化学修饰技术,1,、,金属离子置换修饰,2,、大分子结合修饰,3,、肽链有限水解修饰,4,、侧链修饰,(,图：微生物的基因经修饰能够产生所需的酶,),五、固定化酶和固定化细胞,游离酶、游离细胞在酶催化反应中很难反复或连续使用，也很难实现连续化、自动化。,固定化：将游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程，分固定化酶或固定化细胞。,1,、固定化酶的特征,（,1,）反应完成后经过过滤或离心等简单的分离就可回收，重复使用，降低了酶制剂的成本；,（,2,）可以装成酶柱，当底物溶液流经酶柱时，就能发生酶促反应，适合于工业化应用；,（,3,）酶经固定化后，稳定性一般都有所提高。,2,、固定化酶的特点,（,1,）,省去了酶分离纯化的时间和费用；,（,2,）可进行多酶反应；,（,3,）保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性；,（,4,）由于辅助因子存在和细胞内的连续性合成，酶的活力较为持久，半衰期在一个月以上，就有工业应用价值；,（,5,）用固定化细胞反应柱或反应床可连续进行发酵，一边加入培养基，一边排出发酵液，可避免产物对酶活性的抑制。,3,、固定化酶的方法,（,1,）载体结合法,a,、物理吸附法,是将酶吸附在活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高岭土、硅胶等惰性载体上，此法对酶活性破坏较少，但吸附作用力常较弱而易脱落，因而常与交联法结合使用。,b,、离子结合法,是利用离子键将酶及带有离子交换基团的不溶性载体，如离子交换树脂或带有交换基团的纤维素、葡萄聚糖结合在一起，此法操作简便，酶回收率也较高，但在较强离子强度下进行酶反应时易于脱落。,c,、共价结合法,是利用共价键将酶和载体加以偶联，但因涉及条件较苛刻而化学反应又剧烈，因而酶回收率较低、操作复杂，但酶与载体的结合相当牢固。,(2),交联法,这是利用双功能试剂将酶分子相互交联而不需要载体。常用的交联剂有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺或乙烯双马来亚胺（形成重氮盐）。此法反应也较为剧烈，从而影响酶的回收，但固定后的酶稳定性较好。,(3),包埋法,a,、网格型,是将酶固定在具有网格结构的高分子凝胶中。通常作为凝胶材料者有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等合成高分子材料以及海藻酸、明胶、胶原等天然大分子材料。此法操作方便，很少改变酶的高级结构，因而回收率高，但在反应中存在“固相”扩散阻力，只适用于小分子底物和产物，机械强度往往也较差。,b,、微囊型,是将酶液包埋在微小（,300m,）的具有半透性高分子材料外壳形成的珠囊中。此法操作较复杂，酶回收率一般不高，但被包埋的酶不易流失，微囊的比表面积很大，一般也只能适用于小分子底物和产物。,六、酶反应器,酶催化反应：在均相或非均相系统中由酶参与的将底物转变为产物的过程。,酶催化反应器：在此反应中所采用的设备,酶反应器 游离酶反应器 均相不可截留固定化酶反应器非均相 可截留不可截留：是指酶一次性分批使用不再回收。,可截留：是通过超滤膜将酶截留在反应系统中。,酶反应器,游离酶反应器 均相,不可截留,固定化酶反应器非均相,可截留,酶反应器 游离酶反应器 均相不可截留固定化酶反应器非均相 可截留不可截留：是指酶一次性分批使用不再回收。,蛋白酶、脂肪酶、-半乳糖苷酶、发酵酶复合物（包埋在脂肪中产生更多醋味）、脱硫酸化酶、脱甲巯基酶（产生挥发性硫化物的酶）、肽酶、脂酶,采用蛋白酶可以将肌肉结缔组织中胶原蛋白分解，从而使肉质嫩化。,（2）分级盐析法,美国20世纪70年代初开始，使玉米淀粉经酶法液化、糖化和异构化并采用固定化技术，工业化生产第一代、第二代和第三代高果糖浆，代替蔗糖作为可口可乐、百事可乐等饮料食品的甜味剂。,二、酶的提取、分离和纯化,（1）蛋白质选择性变性法,（3）保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性；,1965-1974年,淀粉工业的重大突破随着一种可以将淀粉分解成糖的，不含转葡萄糖苷酶的葡萄糖淀粉酶上市，微生物酶类应用于食品工业的首次重大突破于20世纪60年代发生。,常用的交联剂有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺或乙烯双马来亚胺（形成重氮盐）。,乳制品特有香味主要是加工时所产生的挥发性物质（如脂肪酸、醇、醛、酮、酯以及胺类等）所致。,（一）发酵法生产食品级酶要求：安全和卫生,“曲”：长霉菌的谷物；,常用的交联剂有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺或乙烯双马来亚胺（形成重氮盐）。,乳酸 成熟,面包制作中适当添加脂肪酶可增进面包的香味，这是因为脂肪酶可使乳脂中微量的醇酸或酮酸的甘油酯分解，从而生成-内脂或甲酮等香味物质。,发酵 蛋白质 脂肪,对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。,1953-1958年,Watson 和 Crick发现DNA是双螺旋结构,黄酮化合物糖苷酶,第三节,酶工程在食品工业中的应用,一、酶的用途,反应,酶,水解淀粉生产葡萄糖,淀粉,+H,2,O,葡萄糖,糖化酶,-,淀
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