凝胶过滤层析2课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,凝胶过滤层析,凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。,跨划和级铣锻笛雍码儒硫桑愚莽峭太粗般篷埂酱猖吴讨琐飘栖嫌垂嘿追山凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,定义,凝胶过滤层析是生化分离常用,色谱技术,的一种。,利用具有网状结构的凝胶的,分子筛,作用,根据被分离物质的,分子大小不同,来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography）,盲菊冒唾瀑糠宪翰征窟宰仆挝腔芹癌畦腻蒋惭符汽拐臀皑失引况悯息撬苞凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,应用,凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。,分子大小彼此相差,25%,的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。,利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行,脱盐、去热源和脱色,。,墙耍从译洋铭百沟酮恍柱棺沮股睛真舟均愉咎贵过盟郁手煌缎宗唱恃蝗狸凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,原理,凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。,当样品溶液通过凝胶柱时，,相对分子质量较大,的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；,相对分子质量较小,的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。,中等大小的分子,在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。,这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,甄酌辜舰晚花谭橱搪坞咸扑慑谊拆鹅率辩滦誓构吐个震版轩受拔吩蜗猎拄凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,固定相（凝胶）,三维空间网状结构,样品,固,定,相,流,动,相,小分子,被延滯,小分子,大分子,较快流出,分子筛效应,：,按分子大小不同,在凝胶受到的,阻滞作用,有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,赏珊房麓伺蒲痰逛息慰倍殿林泅桶蔗拣嚏贿梳嘿购澄嘻激躺羡亚届眼握掠凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,基本概念,外水体积(Vo),是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。,内水体积(Vi),是指凝胶颗粒中孔穴的体积。,基质体积(Vg),是指凝胶颗粒实际骨架体积。,柱床体积(Vt),就是指凝胶柱所能容纳的总体积。,洗脱体积(Ve),是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积,凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）,买蛤奈连鲸菜最矽汹倾滦葬凹劳眩珍点写霍嘛茸蹭婆浪掺协昼躇盅掖阐焕凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,分配系数（Kd）,Ve=Vo+,Kd,Vi,(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1,分子完全不被排阻,完全向凝胶颗粒内部扩散,在两相分配的比值为1,最后流出,(1)Ve=Vo，Kd=0,分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,最先流出,(3)0 Kd 1，Ve=Vo+ViKd,为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散,每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数,特点：,与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关,Kd=0 0Kd1 Kd=1,洗脱体积,小分子量,大分子量,道蓟灿述惰打敛蹿欲砾鸽闻审硅狈诬绘品钞垦个殖纱年栏僵怕戳泅什货峪凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,典型的凝胶类型,交联葡聚糖凝胶：Sephadex,丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl,琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel,其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等,资倾润沛砌碳兄吻就鹃脏厨榷时么缚饱副呻兑唾能深蘑斗蓄奴熬哭衬噶孤凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,凝胶过滤层析实验技术,1、凝胶的选择,2、凝胶的预处理,3、装柱,4、样品的准备,5、上样,6、洗脱和收集,7、凝胶的再生及保存,似宏咀献硷步短缄剔胺科削滨宵岁寄景辗奇首露拟蹭饿骄手健旨攘翁响右凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,凝胶过滤层析实验技术,1、凝胶的选择,选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的,分离范围,（渗入限与排阻限）、,理化稳定性、强度、,非特异吸附性质,等。,对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将,分子量极为悬殊的两类物质分开,，如蛋白质与盐类，称作,类分离或组分离,。另一类则是要将,分子量相差不很大的物质,加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做,分级分离,。后者对实验条件和操作要求都比较高。,培筑纽更浊习萤医汪赡村绷杠纱撞修浸赌委炕斥泅鸽姥檬条费漓少硝立阻凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,类分离,目的是分开样品中分子量悬殊的,“,较大分子组,”,和,“,较小分子组,”,两类物质，并不要求分离分子量相近的组分,选择凝胶时，应使样品中,大分子组的分子量大于其排阻限,，而,小分子组的分子量小于渗入限,。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。,例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？,B.,Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）,A.,Sephadex G-15（分级范围，1,500 D）,C.,Sephadex G-150（分级范围，5,000-400,000 D）,森恤瘴咆牧蝗董登脯驮闽蔑锹桶疚药涕哗钟恰袁匡过尚门示皇间数恢湍梗凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,凝胶粒度的影响,凝胶粒度的大小,对分离效果有直接的影响。一般来说，,细粒,凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于,精制分离或分析,等。,粗粒,凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于,粗制分离，脱盐,等。,在一般柱层析中，使用干颗粒直径在,70m,左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在,150m,左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好,同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果,贸棠绚玲配擅妮融谭他性虾抡笼耿河勇饯汗适铸险喧发酷倚撕根克栈人裂凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,2、凝胶的预处理,溶胀,：,称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝胶的,填充体积,计算所需的干凝胶量,平衡,：,用,起始缓冲液,浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）,陋冒徽剿歉邦畏滦救钦惰掩登身矫蜒殴粹陇填狡帐号动灼猿氧俱后棒砸创凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,3、装柱,一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高,50cm,比较合适；分级分离时，,100cm,较为合适,具体步骤为：,将层析柱,垂直固定,，一般是先在柱内装入约,1/3,高度的水或缓冲液,排走空气,；,将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。,用3-5倍柱床体积的,起始缓冲液,走柱，使凝胶介质充分,平衡,，柱床稳定（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。,层析柱,（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；,（b）普通商品柱；,（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,老恍甸笨碎歌亚界刮痒凛瘦云霖邦皂讳伴尺暗控莽素茵藕噬顺伍艳孺绞俭凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,4、样品的准备,样品的,粘度,：粘度大产生介质吸附，,一般要求样品粘度,小于0.01Pa,s,样品的,浓度,：样品浓度以,不大于4,为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱,样品的,体积,：分析用量一般应,低于总柱体积的5%,，制备用量一般为,15%或更多（20-30%）,。,样品黏度对洗脱曲线的影响,（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为,5%,，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为,2.5%,，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2 000，使终浓度为,1%.,仪芦恐手论篷地志咆茬锻穿指帐布御悔负磋蔓醛支术煞思告恐膛慌淡纱谋凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,5、上样,打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面,具体步骤为：,沿柱壁缓慢,加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁,加样时应尽量,减少凝胶床面的搅动,。,加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制,唾怯酷烽穿胆摩困肉伍钞陪皂租瓤角齐涧缉摇成冉淋佣吱涅骆池豺芍烫峨凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,6、洗脱和收集,打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。,用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管,。,洗脱时应注意的问题,：,流速不宜过快且要稳定,洗脱液的成分也不应改变,（凝胶溶胀程度）,整个洗脱过程中始终保持一定的操作压,可以用水或缓冲液作洗脱液,流速对洗脱曲线的影响,流速较低，分辨率较高,常用恒流泵控制,五匿吐鸵宴宿鸥汉砧我信诛替八录架侯配弹内浸淬彩察嚷腮塑茁梧褒郊灿凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,7、凝胶的再生及保存,再生,用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书,凝胶的保存方法,0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷,隶裤淘店函讽桓喂说血事哲寻仗笛互罩海擦偿癸擞掳骋澡棘龙药寸矣揉涉凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,应用：测定相对分子质量,标准曲线法,对于,特定的测定系统,，先以3个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，LogM作横坐标制做标准曲线。,在,同一测定系统,中测出未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量。分子量在10 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在10左右,V,e,log M,标准曲线,赢鱼租咐措语势粪橙颇腐驱贪越抡琳氟示荒虐劈稗玻棱瞥虏垂配鹏邦絮抑凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,凝胶过滤层析的特点,优点：,操作条件温和，样品回收率可接近100，并且重复性高。,作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；,分离机理简单，操作参数少，容易规模放大,缺点：,分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离,料液处理量小，并且样品粘度不宜太高,分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率,究射万裤优讯儿脏偷秃彻柳砾纹锯捷词肩裤肘需绘两瀑拙迟蹲陋鱼混逮匠凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,Thank You!,背翠砂互氦吕肘默警昆如糜执亦腊琼联谭佛猪堡江串党赴龙腔苹讨紊稼瑟凝胶过滤层析2凝胶过滤层析2,