实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,(1),学习,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。,(2),掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。,实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（,Acr,）和交联剂,N,，,N,甲叉双丙烯聚酰胺（,Bis,）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。,实验原理,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的,净电荷的多少、分子的大小和形状等因素,。,如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写,SDS,）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质,-SDS,复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁,Acr,和,Bis,单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。,化学法,的引发剂是过硫酸胺（,Ap,），催化剂是四甲基乙二胺（,TEMED,）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。,采用不同浓度的,Acr,、,Bis,、,Ap,、,TEMED,使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。,Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但,这次实验是利用,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白。,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行；包括浓缩胶（积层胶）和分离胶。,这次实验是利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白,材料与试剂,1,材料：,标准样,BSA,（小牛血清白蛋白）,已经与上样缓冲液混合完毕,2,试剂,1,）,30%(Acr)/0.8%N,N-,甲叉双丙烯酰胺（,BIS,）,2,）,5SDS,电泳缓冲液,稀释成,1,3,）,Tris-HCl/SDS,浓缩胶,pH 6.8,4,）,Tris-HCl/SDS,分离胶,pH 8.8,5,）,10%,过硫酸铵,(AP),6,）,TEMED,商品试剂,材料与试剂1材料：,实验步骤,1,装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。,实验步骤1装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。,2,制分离胶：按所需的浓度配制,12.5,分离胶,。,TEMED,最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡；,灌完分离胶后在胶面上小心加,1,毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）,30%Acr-Bis,Tris-HCl pH 8.8,H,2,O,10%AP,TEMED,5ml,3ml,4ml,120,l,20,l,2制分离胶：按所需的浓度配制12.5分离胶。,3,制,浓缩胶,：按所需的浓度配制,4%,的,浓缩胶,，配方如下：,30%Arc-Bis,Tris-HCl pH 6.8,H,2,O,10%AP,TEMED,400ul,750ul,1800ul,50ul,7.5ul,3制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：30%,4.,灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。,4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将,5,加样：取大肠杆菌和,BSA,蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样,7.5,L,。,6,电泳：先恒压,80V,，待样品进入分离胶后，调电压为,120V,（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约,0.5cm,时，停止电泳。,5加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜,7,翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染 色。,8,凝胶染色：使用考马斯亮蓝,R250,染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约,15-20,秒，摇床振荡,15,分钟，,回收染液至指定容器,。清水漂洗后加入脱色液（,25%,乙醇，,7.5%,乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次,10,分钟。,7翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染 色。,注意事项,(1)Acr,和,Bis,均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。,(2),玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。,(3),样品槽模板梳齿应平整光滑。,(4),灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。,(5),切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。,(6),电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。,(7),稀释,5SDS/,电泳缓冲液至,1,浓度灌入电泳槽，需,800,毫升。,注意事项,移液枪的使用方法,移液器量程的调节,移液枪的使用方法移液器量程的调节,使用干净的枪头,使用干净的枪头,移液器的使用手法，两档位,吸液,放液,移液器的使用手法，两档位吸液放液,去枪头的方法,去枪头的方法,1.,将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。,2.,在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。,1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻,3.,将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。,4.,取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。,3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上,5.,将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。,6.,如图所示将电极架往下压（约,12mm,），使底面完全接触。,5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，,7.,关上底座开关。,8.,放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。,7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加,