诺贝尔化学奖课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1993年诺贝尔化学奖Kary mullis,PCR 技术,The method of polymerase chain reaction,1993年诺贝尔化学奖Kary mullis,1,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）一个非常简单，然而却是很有用的体外DNA聚合反应。PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应，就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。,聚合酶链式反应（polymerase chain,2,凯利穆利斯（Kary Mullis 1944）1944年12月28日出生于美国北卡罗来纳州的勒诺。穆利斯在南卡罗来纳州的一个小镇度过了童年，成长环境非常宽松，使他享有充分的自由和空间，这为他性格的形成提供了条件。,1962年他在佐治亚州理工学院学习化学，获学士学位；19661972在加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位；接着，先后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校作博士后；1979年任职于Cetus公司，其间发明了PCR技术。,凯利穆利斯（Kary Mullis,3,19861988年任Xytronyx公司分子生物学部主任。从1987年开始在加州任PCR技术与核酸化学的非官方顾问。他现在是加州奥克兰儿童医院和研究所的知名专家，并为几家公司作科学顾问。,19861988年任Xytronyx,4,19世纪50年代，Khorana合成了寡聚核苷酸，同时，他利用合成的寡聚核苷酸DNA合成酶以及DNA，开发出了使DNA扩增的方法。当时，这一领域的研究人员通常都使用Khorana的DNA扩增技术。可以说，这是一个司空见惯的基本技术，谁也没有去想过这种方法的不便之处。,19世纪50年代，Khorana合,5,1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物,6,因此，30年来没有人去改革这个方法，人人都满足于这个方法。就连Mullis本人在大学做基础研究时，也没有想到要去开发一种更简便的方法，以取代Khorana的方法。,因此，30年来没有人去改革这个方法，人,7,1979年，穆利斯进入Cetus公司，从事合成寡聚核苷酸的工作。1981年他担任DNA合成实验室主任，主要任务是加速和优化寡聚核苷酸的合成。80年代初DNA合成仪进入实验室，他对这台原型机提出了许多改进的意见，还试着编写新的程序。由于DNA合成仪的应用使寡核苷酸的合成效率提高10倍。这样，穆利斯能把更多的时间用于计算机上。,PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。,1979年，穆利斯进入Cetus公,8,1983年4月一个周末的晚上，他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒的乡间公路上开着车，他思绪不断，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。他萌发了PCR的构想。,9,整个周末他都在思考着PCR问题，他想DNA合成起始于DNA解链，在一段寡核苷酸作为引物下，聚合酶沿着模板从引物的末端开始进行DNA的扩增，这需要人工加入核苷酸，这一过程在实验室可以实施。他还反复思考能否用两个引物来代替现行的单引物法？如果两个引物的大小不同，结果两条链的序列将同时被测定，而且互为印证；其次，他想能否分两次加入聚合酶，以防止新合成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错搭到新生链中的现象。,整个周末他都在思考着PCR问题，他想D,10,再有，经常使用计算机使他注意到了“循环”，他也想到DNA呈指数增长的趋势；最后他还想到扩增是否具有专一性的问题，因为在合成第一次反应中，人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但穆利斯注意到在第二次及后续的链反应中，由第一次反应得到的那些“长反应产物”只能被扩延到另一引物与模板DNA相结合的部位，过了那个位点，扩延反应就无法进行了（没有模板）。所以PCR产物的长度是确定的。,再有，经常使用计算机使他注意到了“循环”，他也想到DN,11,他开始用人类神经生长因子作为目标序列进行扩增，没有结果。转而他选择PBR322质粒作为模板，实验中通过缩小反应体积来增加各成分的浓度，并将复性温度降低到32，减少每次加入的聚合酶的量，在10次循环后停止，结果他看到一条浅的带。接着，他又对方法进行了改进，增加几次循环，得到的带还是较浅。他又尝试用50kb碱基对的噬菌体做模板，用限制酶将模板降解为2000碱基对左右，扩增没有成功。他再次更换模板改用实验室合成的100碱基对的寡核苷酸作模板，对珠蛋白基因进行扩增，结果得到扩增产物。这期间Cetus公司成立了PCR小组，经全体成员的共同努力，1984年11月，终于得到与预期分子完全符合的扩增量，首次取得可信的结果，证明了PCR的可行。,他开始用人类神经生长因子作为目标序列,12,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆,13,这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年,Cetus公司的Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermus aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶最大特点是耐高温，不需每次加入，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率。此酶被命名为TagDNA聚合酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。,这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物,14,原理简介：PCR 技术的基本原理是,DNA的半保留复制,。由于DNA复制是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。,原理简介：PCR 技术的基本原理是DNA的半保留复制。由,15,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,1234522557294时间（min）温度（）PCR的基,16,PCR技术Polymerase chain reaction,循环过程,1.变性：基因组DNA在95,下加热30s到2min，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。,2.退火：将反应混合物降温至55,，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板引物复合物。,3.引物延伸：迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。置反应混合物于70,，延伸时间由扩增片段长度决定，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3端开始，沿着53的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。,4.循环：循环次数主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多，扩增效率降低，错误掺入率增加。,PCR技术Polymerase chain reactio,17,诺贝尔化学奖课件,18,诺贝尔化学奖课件,19,PCR反应基本条件,1.核酸模板,2.引物,3.dNTP,4.Taq DNA聚合酶,5.扩增反应缓冲液,6.Mg2+,PCR反应基本条件 1.核酸模板,20,操作步骤 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10PCR buffer 5 l dNTP mix（2mM）4 l 引物1（10pM）2 l 引物2（10pM）2 l Taq酶（2U/l）1 l DNA模板（50ng-1g/l）1 l 加ddH2O至 50 l 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，循环30-35次，最后在72 保温7min。3 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10l电泳检测。,操作步骤 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5,21,PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成 cDNA文库；(3)从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。,PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA,22,常用的几种PCR反应,PCR技术有很高的实用性，其方法本身又在使用中不断地得到创新与发展，形成了一系列适用于不同目的的特殊方法。下面介绍一下几种常用的方法：,常用的几种PCR反应 PCR技术有很高的实,23,反向PCR(Inverted-PCR,I-PCR),通常，PCR反应是对一对引物之间的序列进行扩增，而反向PCR可以实现对已知序列两侧的未知序列进行扩增。,因为反向PCR反应中用限制性内切、退火环化、内切的办法使序列的上下游关系发生了转变，即由上游变到下游，由中央变到了两侧。,反向PCR(Inverted-PCR,I-PCR)通常，P,24,诺贝尔化学奖课件,25,诺贝尔化学奖课件,26,不对称PCR（Asymmetric PCR）,典型的PCR反应产生一个特定的双链DNA拷贝，但是在基因分析中，常常需要单链DNA以利于序列测定。,在扩增循环中引入不同的引物浓度，而得到了单链DNA，这种PCR方法就叫不对称PCR。,不对称PCR（Asymmetric PCR）典型的PCR反,27,诺贝尔化学奖课件,28,诺贝尔化学奖课件,29,不对称PCR反应不仅可通过引入不同的引物浓度来造成扩增的不对称，还可以利用两引物的退火温度的不同。,在设计引物时，使引物A和引物B的退火温度相差较大，TmATmB。,在最初的10-15个循环中，选择低的退火温度，使引物都发生退火；在后面的20几个循