第二章2-鉴别-薄层色谱法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 中药制剂的鉴别第二节 理化鉴别,三、色谱法,-,薄层色谱法,薄层色谱法,在中药制剂的定性鉴别中得到广泛的应用，这主要是由于其具有,分离分析,双重功能，大大提高了鉴别工作的灵敏度和专属性，,成为中药鉴别的重要方法和鲜明特色。薄层色谱法还可用于药品的,杂质检查,和,含量测定。,中国药典大多数品种采用,硅胶,薄层色谱法，少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。,1.,薄层色谱法定性的基础,基于,相同物质在同一色谱条件下，表现出相同的色谱行为,这一基本规律，在同一块薄层板上点加供试品和对照物，在相同条件下展开，显色检出色谱斑点后，将所得供试品与对照物的色谱图进行对比分析，从而对药品进行定性鉴别。,2.,特点,简便、快速、易普及、具有,分离和分析,双重,功能，且采用共薄层对照分析法，故,专属性,亦较强。,三、系统适用性试验,(05,版药典新增,),1.,检测灵敏度,主要用于,限量检查,.,采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍（,10,倍）的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一块薄层板上点样、展开、检视，后者应显示清晰的斑点。,2.,分离度,用于,鉴别,时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个,清晰分离的斑点,。用于,限量检查和含量测定,时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，除另有规定外，,分离度应大于,1.0,。,分离度（,R,）,的计算公式为：,R=2(d,2,-d,1,)/W,1,+W,2,式中,d,1,为相邻两峰中后一峰与原点的距离；,d,2,为相邻两峰中前一峰与原点的距离；,W,1,及,W,2,为相邻两峰各自的峰宽。,A,B,W,1,W,2,d,1,d,2,3.,重复性,主要用于,含量测定,.,即,同一供试品溶液在同一块薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的,相对标准偏差,(RSD),应不大于,3.0%,；需显色后测量的相对标准偏差应不大于,5.0%,。,四、对照物的选择,对照物分为对照品（主要为有效成分和特征性成分的单体，也包括对照提取物）和对照药材两种。,对照物的设置,有以下,四种,方式：,1.,对照品对照：,用已知中药制剂某一种有效成分或特征性成分对照品制成对照液，与样品在同一条件下层析，比较相同位置有无同一颜色（或荧光）的斑点，来检测是否含有某原料药材。,可设置一种或数种,对照品。,2.,对照药材对照：,缺乏对照品的情况下使用,四、对照物的选择,3.,对照品和对照药材同时对照,(,“,双对照,”,),为了准确检验制剂投料的真实性，有时仅用对照品无法鉴别出来，这时可增加原药材作为对照药材。,例如,含有黄连、黄柏的制剂，单用小檗碱对照品来鉴别是不足足以说明的，此时应增加黄连作为对照药材进行检视。,要求样品色谱图中的主要斑点应与对照品和对照药材色谱图中的有关斑点相一致，从而大大提高了薄层色谱鉴别法的,专属性和整体性,，可有效地检出药品是否使用了假冒药材。,4.,阴阳对照,由于中药制剂中许多,化学成分和有效成分不明确,，或有效成分虽已明确但又,无对照品,，此时可采用,阴阳对照,法进行鉴别。,阳性对照液制备,：把制剂中要鉴别的某味原药材，按制剂的制法处理后，以制剂相同的比例、条件、方法提取，制成该味药的阳性对照液。,阴性对照液制备,：从制剂处方中,除去要鉴别的该味药材,，剩下各味药则按制剂方法出理后，以制剂相同的比例、条件、方法提取，制成该味药的阴性对照液。,通过样品和对照品的阳性对照液、阴性对照液在同一条件下的色谱图可判断样品中,有无该味药材,，并可观察阴性对照液中,有无干扰,来确定该鉴别的专属性。,实例：,枳实导滞丸中黄连的薄层鉴别,P19,五、影响薄层色谱鉴别的主要因素,影响因素较多，例如供试液的净化程度，吸附剂的性能和薄层板的质量、点样（原点）的质量、展开剂的组成和饱和情况、对照品的纯度、展开的距离、相对湿度和温度等。主要的 有以下四个方面：,1.,样品的预处理及供试液的制备,中药的成分复杂，未知成分多，在制剂中往往各种成分尽可能多的提取出来，其中既有欲测成分也有,“,杂质,”,，常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认，因此供试液的净化程度就很关键。,为了得到较清晰的色谱图，供试液的制备要求：被测成分尽可能多的提取出来，杂质要尽可能多的除去。,2.,薄层色谱的点样,点样是关键的一步，既关系到能否得到可重现的薄层色谱，也关系到定量结果的准确与否，不良的点样是测定误差的主要来源。,3.,吸附剂的活性与相对湿度的影响,硅胶为亲水性吸附剂，其含水量越高，吸附活性越弱，自点样开始直展开前，薄层板都是暴露在空气中，其活性取决于空气的相对湿度，薄层板在不同的相对湿度条件下，其吸附活性亦不同，致使薄层色谱重现性较差。,实验室可用适当浓度的,硫酸溶液,来控制展开时的相对湿度。硫酸溶液的浓度越高其吸湿性越大，使得展开室中的相对湿度越小；反之，则越大。,4.,温度的影响,在其他条件相同时，展开时的温差较大会导致斑点扩散及被分离物质的,R,f,值和物质的相互分离度不一致，影响薄层色谱的重现性。,六、仪器与材料（略）,七、操作步骤,一般操作步骤为：,供试液的制备,制备薄层板（制板）点样展开显色与检视,1.,供试液制备：,包括提取和净化（,除去杂质，消除干扰,）,常用的预处理方法有：溶剂提取法（包括冷浸、回流、超声提取）；萃取法，升华法，蒸馏法小型层析柱的柱色谱法、离子交换法等。,2.,制备薄层板（略）,3.,点样,定量点样,.,原点起始线,5mm,8mm,815cm,11.5cm,溶剂前沿,展开剂液面,（展开距离）,(,点样位置,),4.,展开（略）,5.,显色与检视,颜色较深的成分,可直接在日光下检视其斑点。,无色或浅色的成分,多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或再加热使之显色。,有荧光的物质,或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯（,365nm,）下观察荧光色谱。,有的成分,可用试剂的蒸气（如,碘蒸气、氨蒸气,）熏蒸显色。,无色有紫外吸收且不产生荧光的成分,可用,荧光淬灭法,显色。即在含有荧光剂的硅胶板（如硅胶,GF254,板），在紫外光灯（,254nm,）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。,6.,记录,薄层色谱图象可采用摄像设备拍照，以光学照片或电子图象的形式保存。也可以用扫描仪记录相应的色谱图。,7.,结果判断,供试品色谱中，在与对照品、对照药材或对照提取物色谱的相应的位置上，显相同颜色或荧光的斑点，则判断为符合定。,薄层色谱数码,相机成像系统,八、应用实例,黄连、黄柏及含黄连、黄柏的成药,1.,供试液制备,取各品种药粉适量，加甲醇,5ml,，,置水浴回流,15min,，,过滤，滤液浓缩至,1ml,。,2.,对照液制备,取盐酸香槟酒小檗碱，硫酸黄连碱，硫酸表小檗碱，非洲防己碱，药根碱，盐酸巴马汀对照品，加甲醇制成每,0.5mg/ml,的溶液，作为对照品溶液。,3.,薄层板,硅胶,G,自制板；厚度：,500um,4.,点样,分别点样,1-2ul,5.,展开剂,苯,-,醋酸乙酯,-,甲醇,-,异丙醇,-,浓氨试液,(631.51.50.5),；另槽中加入与展开剂等体积浓氨试液。,6.,展开方式,展开室预平衡,15,分钟；上行展开；展距：,8cm,7.,显色,置紫外光灯,(365nm),下检视。,8.,色谱识别,中国药典黄连项下收载有味连，雅连，云连三种，总体分析黄连可见,4,5,个主要的黄色荧光斑点，自下而上，分别为,l.,非洲防己碱,+,药根碱,(,量少,),；,2.,巴马汀；,3.,小檗碱；,4.,表小檗碱,(,云连不含，雅连含量低,),；,5.,黄连碱,(,味连含量高,),。黄柏主要检出巴马汀及小檗碱，可与黄连区别。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18,1.,黄连,(,味连,)7.,小儿化毒散,13.,非洲防己碱,2.,黄连,8.,万应锭,14.,药根碱,3.,黄连,(,雅连,)9.,大补阴丸,15.,巴马汀,4.,黄连,(,云连,)10.,木香槟榔丸,16.,小檗碱,5.,黄连,(,野连,)11.,香连丸,17.,表小檗碱,6.,黄连,(,日本黄连,)12.,黄柏,18.,黄连碱,六味地黄丸中牡丹皮的鉴别,1,12.,一捻金；,13.,人参二醇,+,人参三醇,1.,丹皮酚；,2,5.,六味地黄丸,一捻金中人参的鉴别,牛黄解毒片中大黄的鉴别,1 2 3 4 5,1.,大黄素,2.,大黄对照药材,3,5.,样品,万氏牛黄清心丸中黄连的鉴别,1,5.,万氏牛黄清心丸；,6.,黄连对照药材；,7.,小檗碱,思考题,1.,什么是薄层色谱鉴别法，有何特点？,2.,薄层色谱鉴别法所用对照品有哪些种类？其中哪种方式可有效地检出药品中是否使用代用品。,3.,影响薄层色谱鉴别的因素主要有哪些？,4.,薄层色谱法最常用的固定相（吸附剂）有哪些？硅胶,G,、,H,、,GF254,各代表什么？,5.,点样的注意事项？,6.,薄层色谱显色有哪些方法？,7.,薄层色谱定性鉴别的操作步骤有哪些？在操作过程 中需要注意哪些问题？,