疑难血型问题分析与血型研究新进展课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一 疑难血型问题分析,一 疑难血型问题分析,何为血型？,表型,多糖类,多肽类蛋白类,聚糖，如,ABO,、,P1Pk,、,Lewis,、,H,、,I,、,GLOB,除左侧血型外的其它血型,称组织血型抗原或糖抗原。存在红细胞及中枢以外的组织和体液中。可结合可游离于血浆中。自然界有相似的物质。,发育晚。,称器官血型抗原。主要存在于红细胞和组织细胞。糖蛋,白、脂蛋白,。,发育早。,基因型,何为血型？表型多糖类多肽类蛋白类聚糖，如ABO、P1Pk、除,何为疑难血型,何为疑难血型,（临床）血型工作中所需,各种血型抗体试剂,各种工具细胞,酶,/,化学试剂,各种仪器,各种检测方法,/,实验技术,（临床）血型工作中所需各种血型抗体试剂,工具细胞,标准细胞,筛选细胞,谱细胞,酶处理细胞,特定抗原细胞,用于反定型等,用于意外抗体的发现,用于抗体的鉴定,对冷抗体检出极敏感,;,须设阴、阳性对照试验,;,增强,Rh,及,Kidd,系统、抗,-Lea,、抗,-Leb,、抗,-P,、抗,-H,等凝集反应,对,M,、,N,、,S,、,s,、,Fya,及,Fyb,、,Lua,、,K,、,Kidd,、,Sutter,等抗原决定簇有破坏作用，所以酶法必须与其他方法合用。使用的蛋白酶一般以能检出,128256,倍稀释的抗,-D,为酶活性的大致标准。须冷冻保存。,工具细胞标准细胞筛选细胞谱细胞酶处理细胞特定抗原细胞用于反定,AET,：,溴化,2,胺乙基,lisothiouronium,DTT,：,二硫苏糖醇,ZZAP,：,DTT,和,蛋白酶的混合物,酶与试剂的作用,无花果酶、,木瓜酶、,胃蛋白酶破坏或减弱,M, N, S,Fya, Fyb,Yta, Ch, Rg,抗原；,增强,Rh, P, I, H,和,Lewis,抗原。,酶处理的细胞可以增加抗,JKa,，,抑制抗,JKb,的反应,AET ：溴化2胺乙基DTT： ZZAP ：DTT 和酶与,病人血清,(,抗,E,、抗,c)Ps,结果 结论,细胞,1 CCDEE +,抗,E,细胞,2 ccDee +,抗,c,特定抗原细胞,如：标本有混合抗,E,，抗,c,不能排除时,设,计,抗,原,组,合,病人血清(抗E、抗c)Ps 结果 结论特定抗原,反应条件,反应温度,增加反应时间,改变细胞,/,抗体比例,某些抗体在室温或以下有较好的特异性。,在冷的温度下自身对照是特别的重要，,因为不少血清含抗,-I,或其他冷自身抗体。,抗体最高可达,5-10,倍于细胞体积，,在,37,60,不时摇动，增强抗体反应。,但,Liss,、,PEG,介质不适用。低离子反,应需要一定的比例。,盐水和白蛋白介质需时要,30-60,，,Liss,、,PEG,不可延长，会减低凝集。,改变,pH,pH6.5,使抗,M,反应增强；,pH,6.0,时，,Rh,、,Duffy,、,Kidd,和,MNS,血型失去反应,抗原灭活,DTT/AET,，,ZZAP,反应条件反应温度增加反应时间改变细胞/抗体比例某些抗体在室温,不变的原理多样的技术,试管法,凝聚胺法,凝胶介质法,微孔板法,白蛋白介质法,低离子,Liss,强度实验,抑制技术,Lea,Leb,P1,Sd,a,Chido and Rodgers,物质,如怀疑有抗,P1,可加入,P1,物质,2%,或,30%,的牛血清白蛋白溶液,适用,Rh,系统，对,Kell,敏感性低于抗人球,Liss,红细胞悬液当天使用为好，否则，可使,Fya,、,Fyb,等发生变性，抗原性消失，并在上清液中出现,阻止抗,-Fya,、抗,-Fyb,特异性的活性物质。,有利于混合外观的发现,适合于大规模筛查,盐水,IgM,、抗人球,IgG,等,不变的原理多样的技术试管法凝聚胺法凝胶介质法微孔板法白蛋白介,吸收与放散实验,吸收实验,放散实验,吸收放散实验,热放散,冻融放散,乙醚放散,毛地黄放散,磷酸氯喹放散,冷甘氨酸放散,甘氨酸,EDTA,放散,热放散,IgM,甘氨酸放散,-IgG,吸收与放散实验吸收实验放散实验吸收放散实验热放散热放散Ig,甘氨酸放散,Ac,、,Bc,、,Oc,：游离液,Ac,、,Bc,、,Oc,：放散液,甘氨酸放散：应用液：红细胞,=2:1,；,热放散：生理盐水：红细胞,=1:1,。,凝集,甘氨酸放散Ac、Bc、Oc：游离液凝集, 血型抗原,血型系统,血型集合,901,高频系列,血型系列,700,低频系列, 血型抗原血型系统,22,个血型引起输血反应，,12,个血型引起,HFDN-1,22个血型引起输血反应，12个血型引起HFDN-1,22,个血型系统引起输血反应，,12,个血型引起,HFDN-2,22个血型系统引起输血反应，12个血型引起HFDN-2,RED CELL GENOTYPING AND BLOOD, 9 JULY 2009 VOLUME 114, NUMBER 2 PRETRANSFUSION TESTING 248-256,红色有意义，黄色偶尔，绿色少见,RED CELL GENOTYPING AND BLOOD, 血型抗体, 血型抗体,血型,Ig M,抗体长度大于,350 A,在盐水介质中能直接连接相应的红细胞,使之发生肉眼可见的凝集反应，,Ig M,抗体能引起严重的,血管内溶血,性输血反应。,血型,Ig G,抗体长度约为,240 A,，常经妊娠或输血等免疫产生，在盐水介质中只能致敏红细胞,但不能凝集相应的红细胞,必须通过其他介质,如牛白蛋白、蛋白分解酶法、低离子强度试验及抗球蛋白法等才能显示凝集。,血管外溶血,性输血反应,血型抗体的种类,血型Ig M 血型抗体的种类,何为不规则抗体,指不符合,A BO,血型系统的,Landsteiner,法则、,意外存在于血清中的血型抗体,也就是抗,-A,、,抗,-B,以外的血型抗体。但,A BO,系中的亚型、,变异型抗,-A ,某种抗,-B,等也称为不规则抗体,。,加藤俊明 检查与技术,1988,，,16,（,6,）：,516,何为意外抗体,现在把正常情况下不应当出现在血液,中的血型抗体叫意外抗体。,unexpect,何为不规则抗体指不符合A BO 血型系统的Landstein,自身抗体与同种抗体,自身抗体,同种抗体,自身抗体与同种抗体的共存,自身抗体与同种抗体自身抗体同种抗体自身抗体与同种抗体的共存,疑难血型原因,正反定型不符,抗原或抗体减弱,直抗阳性,/,自身凝集,多凝集现象,低频抗原,高频抗体,无抗体时的窘境,混合抗体,各种疾病原因的标本,抗原的问题,抗体的问题,介质问题,疾病问题,稀有血型,疑难血型原因正反定型不符抗原或抗体减弱直抗阳性/自身凝集多凝,抗原的变化,抗原减弱性、“消失”,疾病,干扰,突变,其他,抗体的变化,抗体减弱,抗体消失,抗体出现,其他,抗原,/,抗体变化,抗原的变化抗体的变化抗原/抗体变化,正常的,ABO,系统凝集结果几乎为,3+4+,；,变弱的抗原要考虑亚型的问题；,重视抗,H,的检测；,不忽视混合外观；,CisAB,与,B(A),的“多见”；,CisAB,：,A,抗原较强、,B,较弱，有抗,B,，抗,H34+,；,B(A),：,B,抗原较强、,A,较弱,2+,，抗,A,强与,A1,、,A2,反应，抗,H34+,；,A(B),：,A,型与单抗,B,反应，抗,H,增强,17,th,p368,。,正反定型不符,正常的ABO系统凝集结果几乎为3+4+；正反定型不符,采用的方法, H抗原检测；,吸收放散试验；,增强法；,唾液中,ABO,物质检测；,ABO,基因分型技术；,几种情况的分析,红细胞与抗A、抗B及抗AB的凝集强度,血清中是否存在抗A1,与人源抗A、抗B反应强度,红细胞上H物质的强弱（OA、B亚型BA2BA1A1B、,孟买及类孟买H抗原阴性）,分泌型人的唾液中A、B和H物质,ABO,亚型的分析,几种情况的分析红细胞与抗A、抗B及抗AB,关注,H,抗原与抗,H,关注H抗原与抗H,生理：年龄老人与婴儿、亚型、冷凝集素、先天无抗体；,实验：血清与血浆、试剂问题（效期、污染）如抗,A,、抗,B,试剂的特异性、敏感性、匀质性。抗,D,试剂表位的针对性； 、加样顺序、细胞洗涤、弱凝与溶血等等；直抗、抗筛、抗体鉴定、是否需做对照,(,本室：直抗、自身） ；,标本问题：输血前后、稀释、高分子药物的钱串状、近期输血的混合外观、移植等、抗体治疗的影响。血清还是血浆；肝素对,Polybrene 的影响,、对基因检测的影响；,疾病：白血病影响抗原、肝脏疾病影响抗体、自身免疫病抗体、感染抗原与抗体、低免疫球蛋白血症、急性大失血的新生细胞增加等。,干扰,ABO,血型正确判定的因素,干扰ABO血型正确判定的因素,为了检出各种不规则抗体,试剂红细胞,(,即谱细胞,),应选择含有,D,、,C,、,e,、,E,、,e,、,M,、,N,、,P,、,Le,a,、,Le,b,、,Fy,a,、,K,、,Jk,a,、,Jk,b,、,Dia,等抗原的多个,O,型红细胞。,由于抗,-E,、抗,-c,、抗,-M,、抗,-S,有剂量效应,所以需使用,E,、,C,、,M,、,S,抗原纯合子的红细胞才能检出低效价的抗体。,不规则抗体的筛选与鉴定,为了检出各种不规则抗体, 试剂红细胞( 即谱细,试剂红细胞上的抗原是纯合子，有较高的剂量效应，如,JK,（,a+b-,）、,Fy,（,a+b-,）；但病人红细胞上的抗原是,Jk(a+b+),。出现阴性结果。,病人红细胞上没有表达相应的抗原，这类抗原通常是中度频率的稀有血型抗原，如,K,、,Lua,、,Coa,、,Ytb,，但试剂红细胞存在。出现阳性结果。,为什么交叉配血阴性而抗筛阳性？,试剂红细胞上的抗原是纯合子，有较高的剂量效应，如JK（a+b,临床,RhD,的定型：,IgM,试剂,RhD,的确认：,3,个不同克隆的试剂；,IgG,（人源）、,IgG,、,IgM,、,IgG+IgM,；,RhDel,的检测：,吸收与放散实验检测；,临床,RhD,血型的定型如何做？,临床RhD的定型：IgM试剂临床RhD血型的定型如何做？,直抗阳性 血型的定型,配血,自身凝集 血型定型,配血,如何处理,直抗阳性,/,自身凝集,直抗阳性 血型的定型直抗阳性/自身凝集,多,/,全凝集现象的分析,冷凝集现象,特异性多,/,全凝集现象,常见的冷凝抗体,冷自身,/,同种抗体,非特异性凝集,认真处理标本,更换检测方法,多/全凝集现象的分析冷凝集现象特异性多/全凝集现象常见的冷凝,间抗试验、,4,或室温的盐水直接反应结果、自身凝集,试验、无花果蛋白酶 或木瓜蛋白酶 处理的谱细胞反应,没有明显免,疫产生的,抗体包括,抗,H,(,表型是,Bombay or Oh),抗,PP1Pk,(,表型是,p (Tja-),抗,P,(,表型是,P1k,或,P2k),抗,JKa3,(,表型是,Jka-b-),抗,Rh17,(,表型是,D+C-E-c-e-),抗,Ge2,(,表型是,Ge2-),抗,Ge2,(,表型是,Ge2-),抗,Vel,(,表型是,Vel-),间抗试验、4或室温的盐水直接反应结果、自身凝集没有明显免,基本思路,抗体筛查,（,、,、,）,血清,/,血浆,放散液抗体,酶处理细胞,不同温度,不同介质,分离细胞与血清,检测（低频）基因,检测（低频）表型,血清学验证,抗体鉴定,（谱细胞）,有血清学试剂,无血清学试剂,常见血型定型,正反、直抗、自身,更多血型定型,（全凝集,/,溶血）,直抗阳性，,采用放散,基本思路抗体筛查血清/血浆分离细胞与血清检测（低频）基因检测,充分了解病史,！,输血、怀孕,血液制品,IVIG/RhIG,化学药品,移植,产生了意外抗体,充分了解病史输血、怀孕血液制品IVIG/RhIG化学药品移植,发现冷、温自身抗体,冷自身抗体：,4,、,22,、,30,；温自身抗体：,37 ,盐水,聚凝胺,抗人球,4 ,、室温、,37 ,反应,自身,RBC +,自身血清,常见冷自身抗体：,-I,、,-i,、,-H,、,-Pro,常见冷同种抗体：,-M,、,-N,、,-P1,、,-Lea,、,-Leb,、（,-A1,）,发现冷、温自身抗体冷自身抗体：4、22、30；温自身,含冷自身抗体的,RBC,的处理,压积红细胞用,37,盐水,/PBS,洗,3,次以上,/56 10,，至自身细胞不凝（干净）后用于,ABO,正定型及交叉配血,，,自身吸收,。,含冷自身抗体血清的处理,含冷自身抗体血清,2,份,+ “,干净”细胞,1,份，混合后,41hr/,过夜；至含冷自身抗体血清与,“,干净”细胞不再凝集后用于,ABO,反定型及交叉配血,，,与谱细胞反应检测抗体特异性,。,交叉配血,：吸收后的病人血清,+,供者红细胞， 盐水,/,聚凝胺,/AHG,“干净” 的病人细胞,+,供者的血清，盐水,/,聚凝胺,/AHG,冷抗体效价测定,1.,取,3,排试管各,10,只，均加,1,滴盐水；第,1,管加,Ps1,滴倍比稀释；,2.,每管加,5%“,干净”细胞,/O,型细胞,1,滴；,4 ,、,22 ,、,37 ,放置,1hr,；,3.3500rpm15,，出现,1+,的最高稀释度为患者血清抗体效价。,冷自身抗体的处理与鉴定,含冷自身抗体的RBC的处理冷自身抗体的处理与鉴定,含温自身抗体的,RBC,处理,(,直抗阳性,),*各种放散实验如热放散、甘氨酸放散、酶处理等。,*如直抗,2,，常为,ABO,以外抗体，常用用乙醚放散。,*3,洗后,RBC1,份,+1%,木瓜酶,1,份,37,103,洗后为干净细胞。,温自身抗体的血清处理,*含温自身抗体血清,2,份,+ “,干净”细胞,1,份,+1%,菠萝酶,1,份，混合；,37 ,吸收,1-2hr,；,1500rpm5,取上清；,*吸收后的,Ps,血清做,ABO,反定型及交叉配血,，,与谱细胞反应检测抗体特异性。,含温自身抗体的交叉配血,主侧：,吸收后的病人血清,+,供者红细胞；盐水,/,酶,/,聚凝胺,/AHG,次侧：,“干净”的病人红细胞,+,供者血清；盐水,/,酶,/,聚凝胺,/AHG,温自身抗体的处理与检测,含温自身抗体的RBC处理(直抗阳性)温自身抗体的处理与检测,药物抗体的鉴定,药物红细,胞的制备,600mg,青霉素,300mg,头孢,甲基多巴,+,红,细,胞,371Hr,药,物,红,细,胞,药物红细胞,1,份,未处理红细胞,1,份,Ps2,份,+,371Hr,加,AHG,有,无,凝,集,+,-,IgM,IgG,药物抗体的鉴定药物红细600mg青霉素300mg头孢甲基多巴,1.,抗体筛选细胞：发现有无意外抗体： 室温盐水、,37,、,AHG,2.,谱细胞：鉴定抗体特异性： 室温盐水、,37,、,AHG,当出现疑似混合抗体存在时,3.,特定细胞吸收的放散液与谱细胞反应，确认抗体特异性；,4.,抗体稀释后与谱细胞反应；,5.,冷自身抗体与同种抗体混合的检测：用“干净”后的,RBC,与血清冷吸收，吸收后的血清与谱细胞反应；,6.,温自身抗体与同种抗体混合的检测：用“干净”后的,RBC,与血清温吸收，吸收后的血清与谱细胞反应；,7.,酶细胞的处理：,混合抗体的检测,1.抗体筛选细胞：发现有无意外抗体： 室温盐水、 37、A,假阳性反应,：可能与以下因素有关：,1.,抗球蛋白血清或试剂红细胞被细菌污染。,2.,网织红细胞异常增多。由于结合于网织红细胞上的运铁蛋白同抗球蛋白血清中的抗运铁蛋白反应,从而产生假阳性。此时须用单价抗,IgG,鉴别,反应为阴性。,3.,红细胞在体外摄取补体,同广谱抗球蛋白中的抗补体反应,所以应注意抗凝剂的选择。常用,EDTA,抗凝剂,使,Ca2+,赘合,以避免血清中补体激活,出现假阳性反应。,4.,离心速度过高,或抗球蛋白试剂中留有微量种族抗体。,抗人球蛋白试验出现错误的原因,抗人球蛋白试验出现错误的原因,假阴性反应,：可能与以下因素有关：,1.,红细胞洗涤不充分,残留的球蛋白量如果超过,2mg / m l,将中和抗球蛋白试剂血清,出现假阴性反应。,2.,广谱抗球蛋白试剂中缺乏,/,不足抗补体的抗体。,3.,试验步骤的延迟或中断,特别在洗涤期间可导致抗体从红细胞上解离。,4.,孵育时间不充分,温度不合适等。,假阴性反应：可能与以下因素有关：,病 例 讨 论, 病 例 讨 论,病例,1,正反定型不符,-ABO,系统,病例1正反定型不符-ABO系统,病例,2,李美霖等,中国输血杂志,2013-8,期,正反定型不符,-ABO,以外,天然抗,-P1,引起,ABO,定型困难一例,血,型,鉴,定,2-,Me,处,理,后,均,不,凝,，,应,为,IgM,型,抗,-P1,抗,体,患者为,B,型,但反定型全凝,病例2李美霖等中国输血杂志正反定型不符-ABO 以外,病例,3,抗,Tja,导致,ABO,正反定型不一,吴红等中国输血杂志,2011-11,期,应为,Ps,抗,Tja,抗体有,IgG,或,IgM,型或同时具有。,4,、37,溶血。为补体介导，故用,EDTA,处理避溶血。,关键看反定型全凝,正定缺,-AB,、,-H,病例3抗Tja导致ABO正反定型不一 吴红等中国输血杂志,病例,4,李宝亮等,中国输血杂志,2013-11,期,混合抗体：,Rh,抗体联合抗,M,致配血困难,患者血型,B,、,DCCee,、,M-N+,；疑有盐水,-M,；,AHG-E,、,-c,？,检出室温盐水,IgM,抗,M,37,时无活性为冷抗体；,IgG,型,-E,、,-c,或,-Ec,？,-c+-P1,？,病例4李宝亮等中国输血杂志混合抗体：,采用,Dccee,（,1,号）、,DCCEe,（,2,号）特定抗原细胞进行,吸收后,放散,，放散后的抗体进行谱细胞检测，,1,号检出,-c,2,号检出,-E,采用Dccee（1号）、DCCEe（2号）特定抗原细胞进行吸,病例,5,于笑难等中国输血杂志,2013-11,期,抗,Fya,导致配血不合,患者血型,AB,、,DCcee,、,MNss,、,Fya-b+,Ps,与抗筛细胞阳性，随后用谱细胞在盐水、酶介质作抗体鉴定见下表。进一步分析病人,可能有抗,Fya,。用,Fya+b-,吸收,Ps,的血清与,10,号细胞不反应，放散后的血清与,10,号细胞反,应，证实有抗,Fya,，效价,1:16,。,IAT,病例5于笑难等中国输血杂志2013-11期抗Fya导致配血,正定型 反定型,抗,A,抗,B,抗,AB Ac Bc Oc,- - - 4+ 12+ -,抗,H,Pc Bc Oc,4+ 2+ 3+,吸收放散实验,Pc,、,Bc,放散液抗体检测：（,-,）,、（,+,）,病例,6,血型是表型检测的结果,正定型,二 血型研究进展,二 血型研究进展,近年来，分子测序技术的广泛采用，对血型形成的分子机制有了清楚的了解,更近些年来，血型研究中采用了模式动物学分析手段，分析研究血型分子的生物学作用,采用,x-,射线衍射分析技术，分析血型蛋白的分子结构，从而了解血型分子的作用点与差异,计算机技术和测序技术的飞速发展，产生了一门新的生物信息学，汇集海量信息的数据库成为研究血型的重要工具,近年来，分子测序技术的广泛采用，对血型形成的分子机制有了清楚,血型抗原,/,命名 血型基因,/,室间质评,2006,年,Cape town,MNS3,个抗原、,kell2,个抗原、,Scianna2,个、,Cromer2,个、,Indian2,个、,Knops1,个、,JMH4,个,2008,年,Macao,System 30: RHAG,（,CD241,）,：,Duclos,、,Ola,、,DSLK,组成。,2010,年,Berlin,P1PK,的,intron1,有了,exon2a,、,Rhdel 58,、,59,抗原、,CO1,个、,Gerbich,的,GE10,、,11,、,12,、,Cromer,、,JMH6,个；,Collection 209,成为新系统,:,GLOB,；产生了新,Collection 213,2005,年,2007,年 室间质评,2009,年,2013,年标准试剂的研制，,此为重要的趋势,。,4,个,RBC1,，,RBC4,，,RBC5,和,RBC12,基因分型及抗,-HNA-1a,的,WHO,参比试剂，用于及保证试剂的敏感和特异。,血型抗原/命名 血型基因/室间质评,ISBT 33,-GenBank 34,血型系统,ISBT 33-GenBank 34 血型系统,RhD/CE,合成不能缺少的,RhAG,血型系统,Rh-associated glycoprotein Blood Group System,原来,RhCE,，,RhD,，,RhAG,是一个系统，现在,RhAG,为一个独立的系统，,RhAG,是,Rh50,糖蛋白。,RHAG,由,10,个外显子组成与,RHCE/D,（,1p36.1,）有,36%,序列一致性。位于染色体,6p12.3,。,12,次穿膜。,RhAG,是,RhD,和,/,或,RhCE,形成所必须的。早期绿藻研究发现这些蛋白作为,CO2,气体的通道；最近在各种,Rh,同源性的系统发育学、生理学、结晶学研究强烈提示,Rh,作为,CO2,气体转运，但铵的转运依然值得讨论。,RHAG,表达限制在红系组织。,非红系的同源性产物表达在肾脏、肝脏、皮肤、睾丸和大脑,。,RhD/CE合成不能缺少的 RhAG血型系统Rh-a,第,3,系统,P1PK,与第,28,系统,GLOB,的关系,一个共同的前体：糖基化神经酰胺,两个基因：,A4GALT,；,B3GALNT1,四个抗原：,P,、,P1,、,Pk,、,NOR,P1Pk,系统：,P1,、,PK,、,NOR,GLOB,系统：,P,p,是无,P,、,P1,、,Pk,抗原,有抗,PP1Pk,抗体，即,Tja,抗体,第3系统P1PK与第28系统GLOB的关系一个共同的前体：糖,至今未被,ISBT,命名的,T/Tn,血型系统,基因位点,- C1GALT1(,编码,T-synthase), C1GALT1C1(,编码,chaperone Cosmc),潜在的红细胞抗原。,T,抗原是粘蛋白的氧联蛋白；,Tn,抗原：,T,表位的,-1,3-,半乳糖基化缺失，阴性。,Tn,的,-1,3-,半乳糖基化产生,T,表位。,Tn,和,T,抗原是许多氧聚糖的前体。,Tn,和,STn,在人类肿瘤细胞中有很高的表达 ，在某些肿瘤中有,90%,。,Tn,尤其是,T,抗原可以刺激半乳糖介导的肿瘤细胞的粘附。,最近，试图开发基于,Tn,的疫苗。,至今未被ISBT命名的 T/Tn 血型系统基因位点 -,血型与病原、疾病,统计,FY,（,a-b-,）的个体感染,HIV,比其他表型的人高,40%,。所幸的是国人的,FY,（,a-b-,）频率极低，黑人高达,68%,。超表达的抗原与好的预后有关。,众多调查提示在人类,ABO,血型的起源、分布、相对比例，可能直接受到来自于恶性疟原虫感染的选择性基因压力。,GPC,是恶性疟原虫受体；,Ge,阴性红细胞抵抗疟原虫的侵入。,Ge,阴性表型在巴布亚新几内亚部分地区很常见,。,血型与病原、疾病 统计FY（a-b-）的个体感染,P1PK,系统抗原,*作为受体起作用，在肠道细菌的粘附如大肠埃希氏菌、猪链球菌、绿脓假单胞菌 、志贺氏杆菌、肠出血性大肠杆菌有关；,*作为受体，,与人细小病毒,B19,结合,；,*在,HIV,侵入中起协同因子作用；,*细胞毒性,IgM,和,IgG3,抗体在抗,P,和,/,或,Pk,的自发性流产中 比例较高；,P1PK系统抗原,人红细胞膜主要的表面蛋白,Band3,：,anion exchanger1,，,AE1,。阴离子交换蛋白，,膜蛋白电泳处于第,3,条带，占,RBC,膜总量的,25%,。膜骨架,主要附着点，参与多种物质和信息的跨膜传递和功能调节。,疏水性跨膜域的生理功能是介导,Cl/HCO,交换,在完成组织,CO2,运输、肺,CO2,排出过程中发挥重要作用,人红细胞膜主要的表面蛋白Band3：anion exchan,电子（交叉）配血,电子配血的前提：供者、患者没有意外抗体，采用相同血型的血液相输血；,电子（虚拟）血库：将血库中的血液前移至手术（输血）室，在电子配血的基础上，满足患者及时的输血要求；,注意点：多抗原的确认、抗体筛查、直抗,/,间抗的完成；,试剂及细胞谱的一致性,。,电子（交叉）配血电子配血的前提：供者、患者没有意外抗体，采用,三年来,Nature Genetics,连续发表红细胞血型新系统的研究成果,IF=35,Teresa Zelinski,等,ABCG2 null alleles define the,Jr(a),blood group phenotype ,Nature Genetics,44, 131132 (2012),Carole Saison,等,Null alleles of ABCG2 encoding the breast cancer resistance protein define the new blood group system,Junior,Nature Genetics,44, 174 177,（,2012,）,Virginie Helias,等,ABCB6 is dispensable for erythropoiesis and specifies the new blood group system,Langereis,Nature Genetics,44, 170173 (2012),Jill R Storry,等,Homozygosity for a null allele of SMIM1 defines the,Vel-,negative blood group phenotype ,Nature Genetics,45, 537541 (2013),Ana Cvejic,等,SMIM1 underlies the,Vel,blood group and influences red blood cell traits ,Nature Genetics,45, 542545 (2013 ),三年来Nature Genetics连续发表红细胞血型新,三个新血型的生物学作用,Junior,血型抗原系统,：,Junior,，,JR,或,Jr(a),。,Jr(a),蛋白由,ABCG2,基因编码。,Jr(a),阴性的人产生抗体。,ABCG2,是人,ATP,（腺苷三磷酸）结合盒转运器,(ATP-binding cassette transporter,ABC,转运蛋白,),G2,。通过限制毒物吸收及运转，维持细胞稳态。,乳腺癌耐药性蛋白,，作为一种,多种药物转运器，肿瘤治疗中的药物耐受与其有关,。,ABCG2-/Jr-,的人对,ABCG2,运输药物高度敏感，通过检查血型可以了解对药物的反应。,存在于造血干细胞、成熟红细胞、几乎所有组织的静脉及毛细血管壁细胞。,三个新血型的生物学作用Junior血型抗原系统：Junior,Langereis,血型抗原系统：,ABCB6,由,ABCB6,基因编码，,Lan,是,MDR/TAP,亚家族成员。,Lan,（,+,）高频（日本除外），抗,Lan,极少。,Lan(-),均为缺失纯合子，,Lan(+),为杂合子或未缺失。位于染色体,2q36,，,19,个外显子组成，长约,9kb,。约,35,种突变造成。,ABCB6,蛋白与血细胞携氧、肝脏解毒和细胞产能有关。现在认为其主要作用是通过转运保护有机体被毒物的损害，同时与多种药物,/,抗癌药物耐药性及抗原递呈有关。能够将卟啉运转到线粒体内部，卟啉是血红素合成所必须的。,ABCB6,卟啉,皮肤型血卟啉病：光暴露区皮肤脆性增加、水疱；,急性卟啉病：胸、腹、背和四肢疼痛，麻痹、抽筋甚至智力错乱。,存在于红细胞、线粒体外膜、及肝癌细胞膜。,Langereis血型抗原系统： A,Vel,血型抗原系统,1952,年病人,Mrs.Vel,的血液由于输血反应，其血液可以凝集许多人的血液，随后其抗体被命名为抗,Vel,。,1975,年确定为常染色体隐性遗传。,2013,年发现转膜蛋白,SMIM1,带有,Vel,的表位。确认,SMIM1,的基因有,17,个核苷酸的缺失。,SMIM1,是一个小基因，有,4,个外显子，编码区域在外显子,34,。在染色体的,1p36.32,，与,RHD,、,RHCE,位点为邻。,Vel血型抗原系统 1952年病人Mrs.,斑马鱼的,SMIM1,基因敲除研究发现有中等程度的,RBC,数量的减少，,SMIM1,转录水平的下降,影响平均,Hb,浓度，,证明是一种新的,RBC,形成调节因子。,Jill R Storry,等证实,SMIM1,是基因，,Vel,是血型,。,Vel,在世界范围内的,阴性频率为,0.04%,，英国,1/4000,，,瑞典北部略高，,中国未知。,存在于成红细胞样的细胞系中。,3,个血型的相应抗体均导致输血反应和,HDN,。未发现由于表型的缺乏影响生命活动。,斑马鱼的SMIM1基因敲除研究发现有中等,班马鱼,Smim1,（转膜蛋白）基因敲除，整体原位杂交技术。生长,3,天的,仔鱼染色观察,Hb,表明成熟的原始,RBC,中等程度的减少。,Ana Cvejic,等,胚胎期的基因敲除,同源杂交植入,胚胎,固化,整体原位杂交,染色,观察,定位,定性,定量,Vel,胚胎期的基因敲除Vel,x-,射线衍射分析技术,x-射线衍射分析技术,分子时代的血型分析,PCR-SSP,基因测序,杂交,扩增测序,克隆测序,直接测序,原位杂交,分子杂交,最为常用的两种方法,分子时代的血型分析PCR-SSP基因测序杂交扩增测序克隆测序,血型基因分型的应用,近期输血的病人；,新生儿溶血病；,直抗阳性的病人细胞；,为分析,AIHA,病人潜在的同种抗体，,AIHA,的细胞往往,DAT(+),；,弱的红细胞抗原；,输血反应；,大规模筛查抗原阴性的供者；,抗体缺乏时；,A,、,B,、,D,等血型不一致时；,RhD,的表型与基因关系。,血型基因分型的应用近期输血的病人；,最为简单，检测已知的位点；,根据目的要求，设计扩增引物，凝胶成像；,单位点,/,多血型；,M,ark,的作用，是标尺；,PCR-SSP,最为简单，检测已知的位点；PCR-SSP,疑难血型问题分析与血型研究新进展课件,测序分析,1.,目的基因的获取, 引物的设计： 制备,DNA,：扩增目的基因,2.,目的基因纯化的方法,去除引物、,dNTP,、盐、非特性,PCR,产物,胶回收法；柱法；酶法：直接在,PCR,管中,进行，,3715,酶消化，再,8015,灭活酶的活性,3.,测序样品的制备,目的基因测序前扩增，目的是结合上荧光染料, 样品不纯化：用于直接测序； 测序样品纯化：,去除未结合的荧光标记的,ddNTP,等物质,4.,纯化的方法：,BigDye XTerminator,法：无需转移测序产物；,Centri-Sep,柱纯化法：,l,测序产物转移至凝胶顶端；,酒精,-EDTA-,醋酸钠沉淀法：,5.,测序,-,毛细管电泳,将纯化后待测基因加入孔板；每孔,10ul,，将,孔板置入测序仪中； 按操作说明书进行操作,测序分析1.目的基因的获取2.目的基因纯化的方法3.测序样品,Exon6 261,一条等位基因出现碱基,G,缺失,297A,G,626G,A,467C,T,297A,G,261delG,Exon7,Exon6 261一条等位基因出现碱基G缺失,1955,年胰岛素全序列测定（色谱和标记技术）；,1960,年,RNA,酶测定；,每个染色体的长度约为,5500,万,-2.5,亿,bp,，目前的一次测序约,500-600bp,，故需通过基因克隆和,PCR,将需要的目的片段取出，进行测序分析；,今天约每一分钟就获知一个新序列；,由于测序技术的日益进步和计算机技术的飞速发展，产生了一门新的学科,-,生物信息学,。采用信息技术来管理和分析海量的生物学基因及相应的信息，并最终为医学与人类健康服务。,生物信息学,1955年胰岛素全序列测定（色谱和标记技术）；生物信息学,信,息,来,源,ISBT,三大基因库,期刊文献,BGMUT,Rh,血型库,GenBank,EMBL,DDBJ,血型信息的来源,信ISBT三大基因库期刊文献BGMUT Rh血型库GenBa,GenBank,，美国国家生物技术信息中心 （,NCBI,）所维护的供公众自由读取的、带注释的,DNA,序列的,总数据库,。,EMBL,(uropean Molecular Biology Laboratory),，,欧洲分子生物学实验室。,Cambridge, UK,。,DDBJ,(DNA Databank of Japan),，日本核酸数据库。,一些其他的专门的基因数据库。,人类基因克隆库,人类基因组,BAC(,细菌人工染色体,),文库；,人类基因探针库,人类染色体,FSH(,荧光原位杂交,),探针库；,小鼠基因克隆及探针库,小鼠基因组,BAC,文库和染色体,FISH,探针库,世界三大基因数据库,GenBank ，美国国家生物技术信息中心 （NCBI）所维,GenBank,EMBL,基因序列,红细胞血型抗原基因,突变资料库,BGMUT,IMGT/HLA,IPD-KIR,IPD-MHC,IPD-HPA,基因序列,GenBankEMBL基因序列红细胞血型抗原基因IMGT/H,美国国家生物技术信息中心,NCBI,Nation center for Biotechnology Information,美国国家生物技术信息中心 NCBINation cente,BGMUT,-,The Blood Group Antigen Gene Mutation Database,CisAB08,A311,A4GAL343T,903G,BGMUT -The Blood Group Antigen,欧洲生物信息研究所,EBI,The European Bioinformatics Institute,欧洲生物信息研究所 EBIThe European Bio,欧洲生物信息研究所,EBI,The European Bioinformatics Institute,到目前已发现,28,个,HPA,欧洲生物信息研究所 EBIThe European Bio,疑难血型问题分析与血型研究新进展课件,Rh/,RH,资料库,Rh/RH资料库,谢 谢,谢 谢,