生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化,1,生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化1,生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化,三个关键问题:,目标蛋白分子病理条件下的大小可能变化。,保护措施到位，避免目标蛋白分子的技术性降解（,-70,C条件下保存，,实验操作通常在冰浴下进行，,充分使用,蛋白酶抑制剂）。,选择合适的分离与纯化方案。,2,生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化三个关键问题:2,分离纯化目标蛋白分子的来源:,一个最基本的原则是方便大量得到。,牛、猪、马、兔和鼠等动物的肝脏或其他脏器组织。,患者的手术组织标本。,培养的人或其他哺乳动物细胞。,细菌或酵母菌。,基因克隆表达。,3,分离纯化目标蛋白分子的来源:3,分离纯化目标蛋白分子的方法:,盐析法,。,有机溶剂沉淀法。,等电点沉淀法。,吸附法。,结晶法。,电泳法。,超速离心法。,柱层析法,。,。,4,分离纯化目标蛋白分子的方法:4,盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理:,蛋白质的溶解度，在低盐浓度范围随着盐浓度的升高而逐渐升高。此过程叫做盐溶(,salting-in,)。,当盐浓度达到一定程度后，再增加盐浓度，此时蛋白质的溶解度不是随着盐浓度的升高而升高，而是逐渐降低，在溶液中出现蛋白质沉淀析出。此过程叫做盐析(,salting-out,)。,不同蛋白质发生盐析时的盐浓度是不同的。这是蛋白质分子的一种特点。利用这一特点可对目标蛋白分子实施分离纯化。这种方法叫做盐析法。,5,盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理:5,-,-,-,-,-,0.6,0.4,0.2,0.0,-0.2,| | | |,等电点pH时，中性盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响,离子强度（,）,lg蛋白质溶解度,1.0 2.0,离子强度,（ionic strength,）计算公式： ,C,n,Z,n,2,/2。,C：,各种离子的摩尔浓度，,Z：,各种离子的所带电荷数。,0.5M,K,2,SO,4,的离子强度,(1,1,2,+0.5,2,2,)/2=1.5,。,1M,NaCl的离子强度,(1,1,2,+1,1,2,)/2=1,。,6,-0.6|,O,H,H,+,_,+,_,+,_,+,_,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,蛋白质盐溶过程示意图,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,蛋白质分子,正负盐离子,7,OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHO,O,H,H,+,_,+,_,+,_,+,_,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,+,_,_,_,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,O,H,H,_,O,H,H,O,H,H,_,_,_,_,_,_,_,_,_,_,蛋白质盐析过程示意图,8,OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHO,蛋白质盐析实验用盐（中性盐）及其优缺点,盐,优点,缺点,硫酸铵,1）,溶解度大，2）溶解度变化温度系数小，3）廉价易得，4）不易引起蛋白质变性，5）分段效果,较,好。,1）,对蛋白氮的测定有干扰，,2）缓冲能力较差。,硫酸钠,1）,对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得，3）,盐析免疫球蛋白效果不错,。,1）30,C一下,溶解度,低,， 2）,溶解度变化温度系数大,。,磷酸钠,1）,效果有时优于硫酸铵，,2）,对蛋白氮的测定无干扰，3）廉价易得。,1）,溶解度,低，,2）,溶解度变化温度系数大,。,氯化钠,1）,对蛋白氮的测定无干扰，,2）,廉价易得。,1）,溶解度,较低，,2）,溶解度变化温度系数大,。,硫酸镁,1）,对蛋白氮的测定无干扰，,2）,廉价易得。,1）,溶解度,较低，,2）,溶解度变化温度系数大,。,9,蛋白质盐析实验用盐（中性盐）及其优缺点盐优点缺点硫酸铵1）溶,蛋白质盐析实验需要注意的几个问题,盐的使用浓度：,不同蛋白质的盐析所要求的盐浓度不同。分离混合组分蛋白质时，盐的浓度由低到高渐次增大。每出现一种蛋白质的沉淀时，则进行离心或过滤，分离所沉淀蛋白质，再继续增加盐的浓度，使第二种蛋白质沉淀。,一个例子,：用盐析分离血浆中蛋白质，1)硫酸铵浓度20时纤维蛋白原析出；2)硫酸铵浓度28,33,时，优球蛋白析出；3)硫酸铵浓度33,50,时，拟球蛋白析出；4)硫酸铵浓度50以上时，白蛋白析出。,10,蛋白质盐析实验需要注意的几个问题10,蛋白质盐析实验需要注意的几个问题,pH值：,通常选择目标蛋白的等电点。,蛋白质浓度：,在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越容易沉淀析出，但蛋白质浓度过大容易引起其他杂蛋白的共沉淀析出,。,温度：,浓盐对蛋白质有一定的保护作用，因此蛋白质盐析操作通常在室温下进行。至于那些对热敏感的酶，则宜维持在低温4,C,条件下进行盐析。,脱盐,：透析法。,11,蛋白质盐析实验需要注意的几个问题11,透析缸,透析液（蒸馏水或缓冲液，加入防腐剂）,透析袋（半透膜）,蛋白质溶液,蛋白质透析脱盐，,4,C下,12,透析缸透析液（蒸馏水或缓冲液，加入防腐剂）透析袋（半透膜）蛋,蛋白质超过滤脱盐，,4,C或,0,C下,蛋白质溶液,半透膜,支持栅板,离心管,13,蛋白质超过滤脱盐，4C或0C下蛋白质溶液半透膜支持栅板离,柱层析法 (,Column chromatographic method),离子交换柱层析,（,Ion-exchange column chromatography,）,分子筛柱层析,（,Molecular sieve column chromatography,）,反向柱层析,（,Reverse-phase column chromatography,）,疏水柱层析,（,Hydrophobic interaction column chromatography,）,亲和柱层析,（,Affinity column chromatography,）,14,柱层析法 (Column chromatographic m,大分子,小分子,凝胶颗粒,装载小分子的凝胶颗粒,分子筛柱层析,（,Molecular sieve column chromatography,),凝胶过滤层析（,Gel filtration column chromatography,),凝胶渗透层析（,Gel permeation column chromatography,),15,大分子小分子凝胶颗粒装载小分子的凝胶颗粒分子筛柱层析（Mol,+,Affinity chromatography,Target proteins,Other proteins,Agarose,Ligand,1,2,3,4,5,16,+Affinity chromatographyTarget,DNA affinity chromatography-1,ACGT,TGCA,ACGT,TGCA,ACGT,1 Sepharose 4B-dsDNA,2 Target proteins,3 Other proteins,17,DNA affinity chromatography-1,ACGT,TGCA,DNA affinity chromatography-2,ACGT,TGCA,ACGT,TGCA,1 Sepharose 4B-ssDNA,3 Target proteins,4 Other proteins,2 dsDNA,TGCA,TGCA,ACGT,ACGT,TGCA,TGCA,ACGT,ACGT,TGCA,ACGT,18,ACGTDNA affinity chromatog,