微生物菌种退化与其复壮保藏

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,2,微生物菌种及其复壮与保藏,微生物菌种及其复壮与保藏,现代微生物发酵工程研究的内容,1,菌种的选育和扩大,2,最经济地利用营养物,，,按需确定培养基,3,灭菌,4,微生物在最优条件下产物的大规模生产,5,发酵产物的提取纯化,6,废物的处理、再生和生产环境的净化,2,2,微生物菌种及其复壮与保藏,微生物菌种及其复壮与保藏,1,工业生产常用的微生物及要求,2,菌种的退化与复壮,3,菌种的保藏,3,2,微生物菌种及其复壮与保藏,工业生产常用的微生物及要求,1.,细菌,:,分布最广,，,数量最多,，,单细胞原核,，,二分裂殖,.,枯草芽孢杆菌,-,淀粉酶、蛋白酶,嗜热乳杆菌,-,乳酸,醋酸杆菌,-,醋酸,棒状杆菌,-,氨基酸,短杆菌,-,肌苷酸,工业生产常用的微生物,4,2,微生物菌种及其复壮与保藏,2.,酵母菌,:,单细胞真核,，,含糖,，,偏酸,，,腐生,，,出芽繁殖,，,假丝,.,啤酒酵母,-,酿酒、细胞色素,C,、单细胞蛋,白、 甘油、琥珀酸,假丝酵母,-,面包、石油脱蜡、饲料,类酵母,-,脂肪酶,工业生产常用的微生物,5,2,微生物菌种及其复壮与保藏,3.,霉菌,:,丝状真菌,生产菌种,:,根霉,，,毛霉,，,犁头霉,，,红曲霉,，,青霉等,产品,:,酶制剂,，,抗生素,，,有机酸,，,甾体激素,工业生产常用的微生物,6,2,微生物菌种及其复壮与保藏,4.,放线菌,:,原核生物,，,有机质丰富的,，,微碱性土壤中,，,无形包子或菌丝片断繁殖,。,生产菌种,:,链霉菌属,，,小单孢菌属,，,诺卡菌属等,产品,:,链霉素,，,红霉素,，,金霉素,，,庆大霉素等,工业生产常用的微生物,7,2,微生物菌种及其复壮与保藏,纯净,健壮,产量,质量,稳定,2,易于控,制培养,条件,周期短,3,对诱变,剂敏感,4,抗污,染力,强,5,原料廉,价,生长,迅速,目,的产物,产量高,6,不是,病原,菌,1,微生物工业对菌种的要求,7,产物,分泌,型,8,2,微生物菌种及其复壮与保藏,菌种退化,：,生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐,减退或完全丧失,的现象。,菌种的退化与复壮,9,2,微生物菌种及其复壮与保藏,退化的表现,产物合成能力下降,产量下降,发酵力或糖化力降低,孢子数量变化,菌落大小变化,生长能力和生长速度变化,10,2,微生物菌种及其复壮与保藏,1.,菌种退化的原因,退化原因,基因突变,质粒的脱落,培养和保藏,条件的影响,连续移代,11,2,微生物菌种及其复壮与保藏,基因突变导致菌种退化：,自发突变与回复突变,10,-7,-10,-9,低产株,低产株,高产株,高产株,12,2,微生物菌种及其复壮与保藏,质粒脱落导致菌种退化：,控制产量的质粒脱落或核内,DNA,和质粒复制不一致。,连续传代加速退化的发生：,大量低,产突变株,传代,个别低产突变株,13,2,微生物菌种及其复壮与保藏,不良的培养条件,：,如营养成分、温度湿度、,pH,值、通气量等和,保藏条件,如营养、含水量、温度、氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。,14,2,微生物菌种及其复壮与保藏,延缓退化,了解退化的原因,分离纯化,科学保藏,减少传代,15,2,微生物菌种及其复壮与保藏,2.,菌种退化的防止,尽量减少传代,16,2,微生物菌种及其复壮与保藏,1,菌种经常纯化,2,创造良好的培养条件,3,用单核细胞移植传代,4,采用有效的菌种保藏方法,17,2,微生物菌种及其复壮与保藏,3.,菌种的复壮及其方法,复壮原理,狭义复壮,：,从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍保持,优良性状的个体,广义复壮,：,在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行,纯种分离与生产性能的测试,工作,18,2,微生物菌种及其复壮与保藏,复壮方法,平板划线,稀释分离,涂布分离,毛细管分离,纯种分离,淘汰法,宿主体,内复壮法,低温等条,件处理,使部分退,化菌株死亡,对于寄生性,微生物的退,化菌株,可通,过,接种到的,昆虫或动物,寄主体内以,提高菌株毒,性,19,2,微生物菌种及其复壮与保藏,2.3,菌种的保藏,一,.,菌种保藏,广义：,在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保管，是指达到,不死、不衰、不污染,以便于研究、交换和使用的目的。,狭义,：,防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优良的生产性能，尽量,减少、推迟负突变、防止死亡，并确保不污染杂菌,。,20,2,微生物菌种及其复壮与保藏,原理,干燥,低营养,低温,21,2,微生物菌种及其复壮与保藏,干,燥,3,液体,石蜡,2,冻,干,4,真,空,5,液,氮,6,斜,面,1,微生物菌种的保藏法,22,2,微生物菌种及其复壮与保藏,(,一,).,斜面保藏法,特点,：,简便有效，易变异，退化甚至死,亡。,适合,：,不要求长期保藏的及不适合冷冻干,燥的。,保存期,:,3,个月,23,2,微生物菌种及其复壮与保藏,影响保藏效果因素,营养略贫乏,氮源略多,糖类少,培养基,1,2,4,培养条件,24,2,微生物菌种及其复壮与保藏,（二）,.,液体石蜡油保藏法,保存期,:,2-3,年，甚至,5,年传代一次,.,特别适合,:,在固体培养基上,不能形成孢子,的丝状担子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、红曲霉等,.,注意：保藏温度，液体石蜡需,灭菌和除水,25,2,微生物菌种及其复壮与保藏,（三）,.,干燥保藏法,适于,:,能产生孢子或芽孢的微生物,沙土,麦麸,硅胶,适合产孢子,的霉菌和放,线菌,适合丝状,真菌和酵,母菌,26,2,微生物菌种及其复壮与保藏,砂土,沙土管,菌种,粒度，除钙，除铁及,pH,。砂和土混合比例：,1,：,1,或,3,：,2,。,121,间歇灭菌,3,次，每次,1-1.5,小时,埋沙土,干法,湿法,细胞浓度,10,8,-10,9,/ml, 0.2-0.3ml/,支。抽真空干燥,4,小时,砂土保藏法,特点,:,经济简便，保存时间长，不易变异。一般,2-3,年,.,27,2,微生物菌种及其复壮与保藏,冷冻干燥法,:,用,保护剂,制备菌悬液， 然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸汽排出，从而使含菌样脱水干燥， 并在真空状态立即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境， 然后置于低温下保存。,特点,：,不易发生变异，,5-10,年。需要冻干机。,适用,：,除了一些不产孢子的丝状真菌外。,（四）,.,冷冻干燥保藏法,28,2,微生物菌种及其复壮与保藏,29,2,微生物菌种及其复壮与保藏,1.,安剖瓶,：,2%,盐酸浸泡,7-10h,。 装入标签，塞上棉花，灭菌备用。,2,保护剂,：,选择适合的种类,。,30,2,微生物菌种及其复壮与保藏,31,2,微生物菌种及其复壮与保藏,成长良好，健壮,无污染,稳定期,高浓度,菌种,3.,菌种制备,32,2,微生物菌种及其复壮与保藏,预冻：,防止泡沫溢出，冻结，升华。,不低于,-20,，,30min,， 疏松状态,时，转入室温抽,1h,， 融封， 检测真,空度，,4,，,避光。,4.,预冻和真空干燥,33,2,微生物菌种及其复壮与保藏,冻干物呈酥块状或松散片状,真空度接近空载时的最高值,以等量水作对照,干燥终止：,34,2,微生物菌种及其复壮与保藏,恢复培养,：,室温下平衡后，加入最适培养基，控制溶化速度，操作靠近火焰。,避免：,样品逸散，污染,。,35,2,微生物菌种及其复壮与保藏,常温下直接真空干燥。设备简单，操作方 便。,适于,:,预冻后易受冻伤的菌株,（五）真空干燥法,36,2,微生物菌种及其复壮与保藏,以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下保藏的方法。,是防止退化的最有效的方法,。,适合于各种微生物的保藏,。,原理,：,菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来,。,（六）,.,液氮超低温法,37,2,微生物菌种及其复壮与保藏,保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋白等。,不同微生物的保护剂不同，需实验确定。,甘油,10-20%,，二甲基亚砜,5-10%,安剖瓶的选择：,95,料或,GG17,的玻璃管制成。,液氮超低温法,38,2,微生物菌种及其复壮与保藏,菌种制备和冻结保藏,：,孢子或菌丝体。,-35,以前,控制降温速度。,恢复培养,:,38-40,水中,注意防护,：,防冻，防爆。,39,2,微生物菌种及其复壮与保藏,1,良好的培养基，新鲜培养的菌种，健壮的菌体，丰满的孢子，适宜的菌龄,2,严格无菌,3,注意保藏菌种的制备质量,4,创造最适宜的保藏条件,菌种保藏注意事项,5,严格控制传代次数,6,恢复培养时，要移接到保藏以前所用的同一培养基进行培养,40,2,微生物菌种及其复壮与保藏,谢谢,41,2,微生物菌种及其复壮与保藏,