红细胞膜蛋白提取流程

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,红细胞膜蛋白提取鉴定,内容,1.红细胞膜提取,2.膜蛋白提取及定量测定（Lowry法）,3.膜蛋白电泳分离、分子量测定,SDS-PAGE,4.western blotting 鉴定,-actin,实验报告要求,：,分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论,手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。,实验分组,每个班分三大组，每组十人左右，选出组长,实验进行一大组为单位,1.纯化RBC膜,2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架）,3.western blot,4.3-4 人一小组测定蛋白质含量,一.红细胞膜提取制备（低渗法,）,原理：,RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血,溶血液。,溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜称为血影,“ghost”,注意事项：,1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”,2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜”,3.缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加,4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mMCaCl,2,可防止此种膜的不稳定性。,5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4C离心。,（,1）RBC分离：,15 ml RBC液,2000rpm 5分钟,RBC（沉淀）3倍体积,等渗,磷酸Buffer,2000rpm 5分钟2,洗净之,RBC,（2）溶血液制备,RBC,加入,低渗,磷酸buffer（1:50),(在 烧杯中）稍搅拌,置冰箱冻格（4,C）溶血过夜,（以上步骤已完成！）,溶血液，用“水泵”吸去上清。！：膜很轻,二、RBC膜纯化（洗涤）,RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组）,9000rpm 5,沉淀（膜）,低渗,磷酸Buffer（pH7.4)?ml（吹打）,9000rpm 54,沉淀,等渗,磷酸Buffer 1ml,9000rpm 5分钟,沉淀（RBC膜）0.6ml等渗Buffer,（即为RBC原液）,三、样品处理：,1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）：,0.3ml,RBC原液,+0.3ml 样品溶解液,沸水浴 5,2.Lowry法测定用样品处理,(3-4 人/group）,：,A,.取0.3ml,RBC原液,1.5ml H2O 150ul NaOH,沸水浴 5,待测管1：,取,A,液0.1ml0.9ml H2O,待测管2：,取,A,液0.3ml0.7ml H2O,四、Lowry法测定膜蛋白含量,立即摇匀，放置15分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以620,比色，读取。,以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。,2.红细胞膜样品蛋白含量的测定,将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定,管号,试剂,H2O (ml),0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,1.0,标准蛋白,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,_,碱性铜试剂,摇匀，放置分钟,酚试剂,含标准蛋白ug,25,50,100,150,200,0,1.标准曲线制备,作图,：,横坐标以标准蛋白含量,纵坐标以A620吸光度值,图比例应为3:2（横：纵）,计算：,在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算,提取膜的 Pr mg数/ml样品,注意稀释倍数,要求,：,计算原提取RBC液的Pr含量,五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量,不连续电泳系统,：,电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）,（一）垂直板安装,每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！,（二）凝胶制备（见表）,先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。,（三）电泳装置安装,先装内槽，试无渗漏；,放入外槽中，加Buffer。,上样品：每孔18ul，2块/组,每块板留一,标准蛋白孔,（四）电泳：,100V进分离胶调至80V,约1.5小时,10分离胶,10 ml,5浓缩胶 5ml,30凝胶储备液,3.3,1.0,蒸馏水,4.0,4.0,1.5mol/L Tris-HCl Buffer,2.5,1mol/L Tris-HCl Buffer,1.0,10SDS,0.1,0.08,10 过硫酸铵,0.06（60ul),0.06(60ul),TEMED,8ul,8ul,加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。,（五）取胶:,用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。,注意：一块半干转移（浸入转移Buffer20min）,另一块考马斯亮蓝染色,染色2小时后，7%醋酸脱色（4）,每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。,分子量计算,1.,测量：cm,a.每条带距离,（起始点至带中心）,b,.,起始至示踪染料距离,2.MR：条带距离(a),MR=,起始至示踪染料距离,(b),a,b,14,100,62,40,30,24,分子量,KD,迁移距离cm,MR,70,55,40,35,25,15,预染标准蛋白,3.半对数图：（六条标准蛋白）,（,参照统计学散点法）,横坐标,为迁移率MR,纵坐标,为LogM,（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）,4.计算待测样品蛋白质分子量：,选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw,9,8,7,6,5,4,3,2,1,0.1 0.2 0.3 0.4.,横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白）,纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）,20,60,100,六、western blotting(-actin鉴定),1.转膜,将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置：,(上）,阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（下）,用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。,开启电源，调电压时间20 v，20分钟,2.封闭,将膜取出TBST中洗5，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗53；,3.一抗孵育,将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3；,4.二抗孵育,将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3；,5.DAB显色,配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟内）；（试剂盒：蒸馏水1ml，A、B、C各一滴放入水中）,6.结果扫描保存,银 染,考马斯亮蓝染色,