紫外可见吸光光度分析方法、应用、软

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,1.,紫外可见吸光光度分析方法,2.,紫外可见吸光光度分析方法的应用举例,3.Win-sp,分光光度计工作站功能,4.Win-sp,分光光度计工作站使用指导,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,1.,紫外可见吸光光度分析方法,1.1,吸光光度分析法基本概念,1.2,紫外可见吸光光度分析法,浓度因子定量计算,标准曲线法定量计算,双波长吸光光度法,多波长吸光光度法,动力学吸光光度法,光谱分析,导数光谱分析,1.2.8,其它吸光光度法分析方法,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,2.,紫外可见吸光光度分析方法的应用举例,2.1,在环境保护中的应用举例,空气中“甲醛”的测定,2.2,在食品安全中的应用举例,食品中“农药残留”的快速检测,2.3,在生命科学研究中的应用举例,DNA/,蛋白质浓度检测,2.4,在医药分析中的应用举例,小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂的导数光谱测定法,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,3.Win-sp,分光光度计工作站功能,3.1,基本测试功能,3.2,具体应用功能,3.3,辅助功能,紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件,4.Win-sp,分光光度计工作站使用指导,4.1,软件的安装,4.2,联机,4.3,光度测试演示,4.4,时间扫描演示,4.5,光谱扫描演示,4.6,多波长演示,4.7,农药残留检测演示,3.Win-sp,分光光度计工作站功能,3.1,基本测试功能,3.1.1 光度测试工作模式,3.1.2 时间扫描工作模式,3.1.3 标准曲线工作模式,3.1.4 光谱扫描工作模式,3.Win-sp,分光光度计工作站功能,3.2,具体应用功能,3.2.1 多波长工作模块,3.2.2 室内环境检测工作模块,3.2.3农药残留快速检测工作模块,3.2.4 DNA/蛋白质浓度检测工作模块,3.Win-sp,分光光度计工作站功能,3.3,辅助功能,3.3.1,文件的存储,3.3.2,图形处理,3.3.3,报告打印,3.3.3,邮件发送,1.1 吸光光度分析法基本概念,吸光光度分析法理论依据,吸光光度分析法是基于不同的分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的分析方法，属于分子吸收光谱分析。,在某一特定波长光的作用下，物质的浓度和吸光度值成正比；在某物质的浓度不变的情况下，改变作用光的波长，吸光度也将发生变化，这表明，分子的吸光度值（,A,）和波长（,）为函数关系，同时和该组分的浓度（,C,）为函数关系。这就是吸光光度法定量分析和定性分析的理论依据。,1.1,吸光光度分析法基本概念,1.1.2.2,分光光度计吸光度值的计算,分光光度计检测器中的模拟信号经,A/D,转换为数字信号，保存到存储器中，这个值我们称为能量值（,Energy,），透过率的计算就是基于能量值。,透过率（,Transmittance,）：,T=,（,Es-E0,）,（,E100-E0,）,100%,吸光度（,Absorbance,）：,A=-log 10T,E100,：吸收池中为参比（可能是空气）时的能量值,E0,：无光束通过吸收池时的能量值,Es,：吸收池中为待测样品时的能量值,1.2,紫外可见吸光光度分析法 浓度因子定量计算,紫外可见吸光光度分析法有定量分析和定性分析；但以定量分析为主。,浓度因子定量计算,溶液的某组分的浓度,C,和吸光度,A,之间存在线性关系，当,A,和,C,之间的关系确定时，浓度,C,可以直读，令,K,为浓度因子，有,C=K,A,浓度因子,K,的取得,1,。由已知浓度的标准样品的吸光度值中计算出,K=C,A,2,。由标准曲线法获得,1.2,紫外可见吸光光度分析法,标准曲线法定量计算,先配制一系列浓度不同的标准溶液，在与试样相同的条件下，分别测量其吸光度，将吸光度与对应的浓度做图，所得的直线称为标准曲线或工作曲线。然后测定试样的吸光度，再从工作曲线中查出试样的浓度。,计算机中标准曲线法定量计算数据处理采用回归分析法。,确定回归直线的原则是使它与所有实验点的误差的平方和为最小值。,设回归方程为：y=a+b x,利用最小二乘法原理，求出回归线的斜率b和截距a。,r为Y 和x 变量之间的相关系数,当 r 0.999 时 表明Y 和 x 之间存在线性函数关系。,1.2,吸光光度分析法 双波长吸光光度法,原理：以样品溶液本身做参比，用两束强度相等、波长不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度,A,1,、,A,2,。设两波长吸光度之差为,A,，样品溶液某组分浓度为,C,，样品溶液某组分浓度和,A,之间因子为,K,。,有：,A=A,1-A,2,C=A,K,双波长吸光光度法主要特点：,可以对浑浊试样进行分析,可以进行双组分或三组分混合物同时测定,在药物分析中有广阔的使用。,1.2,吸光光度分析法 多波长吸光光度法,原理：以样品溶液本身做参比，用多束波长不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度,A,1,、,A,2.A,n,。设每个波长吸光度对应的系数,K,1,、,K,2 K,n,，设,A,为所有波长吸光度的代数表达式之和，样品溶液某组分浓度为,C,，样品溶液某组分浓度和,A,之间因子为,K,。,有：,A=,K,i A,i,C=A,K,其中的系数,K,1,、,K,2 K,n,为经验值,1.2,吸光光度分析法 动力学吸光光度法,动力学吸光光度法是通过研究样品吸光度随时间变化规律，来分析化学反应等平衡过程状态，或借此方法分析某种组分的一种方法。,一般可分为三类：,催化动力学方法（包括酶催化动力学方法）,非催化动力学方法（包括差动力学方法）,诱导方法,测量方法：起始斜率法、固定时间法、固定浓度法。,动力学吸光光度法最基本的测量方式就是时间扫描。,通过时间扫描，我们可以得到样品吸光度,A,的时间数列,A1,、,A2,、,A3.An,对这个时间数列我们可以得到,A,的几个统计指标：,动态范围,平均值 标准差,平均差变异系数,-,标准差变异系数,1.2,吸光光度分析法 光谱分析,光谱分析,光谱分析是通过研究样品吸光度随波长变化规律，来分析样品的光谱（这里狭义为紫外,-,可见光谱）特征，并通过对比某种物质的标准图谱，来定性分析组分性质，并为下一步定量分析提供依据的一种分析方法。,光谱分析最基本的测量方式就是波长扫描。,通过波长扫描，我们可以得到样品吸光度,A,的谱图数据,A1,、,A2,、,A3.An,对这个谱图数据我们常规处理就是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们可以由下面几个属性来描述：,波长,峰高,峰类型,1.2,吸光光度分析法 导数光谱分析,导数光谱分析有一阶导数光谱、高阶导数光谱分析。它是普通光谱分析的补充，当样品的两种组分在普通光谱分析中无法识别时，可以考虑导数光谱分析。,导数光谱的获得有两种方式：,直接通过同时记录两波长的,A,，进行一次完整扫描即可获得。,在计算机内通过程序对普通光谱扫描的结果进行求导获得。,对这个谱图数据我们常规处理就是同样是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们也可以由几个属性来描述（同光谱分析）,1.2,吸光光度分析法,1.2.8,其它吸光光度法分析方法,正交函数吸光光度法,混合组分的测定,流动注射吸光光度法,差示吸光光度法,浮选吸光光度法,固相吸光光度法,计量学吸光光度法,（多组分光谱定量方法）,最小二乘法,逆最小二乘法,偏最小二乘法,非线性最小二乘法,改进矩阵法,卡尔曼滤波法,2.1,在环境保护中的应用举例,空气中“甲醛”的测定,在室内环境检测有五个项目：游离甲醛、氨、氡、苯、总挥发性有机化合物（,TVOC,），其中游离甲醛、氨两项是用分光光度法分析的。,室内环境检测检测以,民用建筑工程室内环境污染控制规范,GB 50325-2001,及,室内空气质量标准,GB/T 18883-2002,作为标准。,“游离甲醛”的检测方法是酚试剂分光光度法,波长为,630nm,。,“氨”的检测方法是靛酚蓝分光光度法,波长为,697.5nm,。,一、“游离甲醛”的检测,(1),检验原理,空气中的甲醛与酚试剂反应生成嗪，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物。根据颜色深浅，比色定量。,(2),检验仪器及软件,1.,分光光度计：,723,可见分光光度计；,2.Win_env,环保工作站；,(3),试剂,吸收液：酚试剂,C6H4SN,（,CH3,）,CNNH2HCI,。,2.1,在环境保护中的应用举例,空气中“甲醛”的测定,(4)工作流程,吸收液等化学试剂的配置,室内环境空气样品采集,标准溶液吸光度测定,样品溶液吸光度测定,结果计算,标准曲线的绘制,2.1,在环境保护中的应用举例,空气中“甲醛”的测定,(7),检测示例,2.2,分光光度计在食品安全中的应用举例,-食品中“农药残留”的快速检测,食品中“农药残留”的快速检测是动力学吸光光度法的一个具体应用。仪器检测过程遵循国家标准,GB/T5009.199-2002,规定的酶抑制率法来检测蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留。,(1),检验原理,检测所用的酶抑制率法是模拟人体温度（,37,C,）环境下，通过测定食品中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留对已酰胆缄酶活性的抑制率，来快速判断农药综合残留量。测定波长,410nm,。,(2),检验仪器及软件,1.,分光光度计：,723,可见分光光度计；,2.Win_Sp,农药残毒检测工作站,；,(3),试剂,1.,提取试剂,2.,酶,3.,显色剂,4.,底物,2.2,分光光度计在食品安全中的应用举例,-食品中“农药残留”的快速检测,(4),检测范围及灵敏度,蔬菜：,叶菜、果菜、豆菜、瓜菜（除胡萝卜、韭菜、茭白、蘑菇）,农药：,有机磷类：甲胺磷、对硫磷、氧化乐果、敌敌畏、甲拌磷、久效磷、杀扑磷等,灵敏度,0.5-5mg/kg,2.,水胺硫磷、甲基对硫磷、甲基异柳磷、乐果等,灵敏度,8-10mg/kg,氨基甲酸酯类：克百威、涕灭威、丙硫克百威、丁硫克百威、抗蚜威、仲丁威、速灭威、残杀威、西维因、叶蝉散等,灵敏度,（对照组用,3,毫升提取试剂代替样本提取液）,2.2,分光光度计在食品安全中的应用举例,-食品中“农药残留”的快速检测,(5)检测流程,取 样（取,2,克样本，非叶菜类,4,克，切碎）,提 取（加入,20,毫升提取试剂，震荡,1-2,分钟，倒出上清液，静置,3,分钟）,抑制反应（于试管中加入,50,微升酶、,3,毫升样本提取液、,50,微升显色剂）,培 养（把配制好的样品或对照组放入,37-38,C,培养箱中培养,30,分钟）,显色反应（取出培养好的样品，加入,50,微升底物，倒入比色杯，立即进行仪器测定）,2.2,分光光度计在食品安全中的应用举例,-食品中“农药残留”的快速检测,(6),检测示例,2.2,分光光度计在食品安全中的应用举例,-食品中“农药残留”的快速检测,农残测试界面,2.3,可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例,-DNA/蛋白质浓度检测,蛋白质和核酸均有紫外吸收的性质，蛋白质在280nm波长处的紫外线有最大吸收，核酸及其衍生物在260nm波长处紫外线有最大吸收，可以通过标准曲线法进行定量测定，也可用二波长、三波长方法消除干扰组分的影响，提高测试准确度。,1.定点波长（280nm）定量测定蛋白质浓度,原理：蛋白质对280nm的紫外线有最大吸收，这是因为含有酪氨酸和色氨酸的缘故，蛋白质溶液的280nm吸收值与其浓度成正比，可作定量测定。,仪器：752分光光度计,试管1.5*15cm（*9）,吸管 0.5ml(*1)、1ml(*3)、2ml(*2)、5ml(*2)。,2.3,可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例,-DNA/蛋白质浓度检测,试剂,卵清蛋白标准液：约,1g,卵清蛋白溶于,100ml 0.9,NaCl,溶液，离心，取上液，用克氏定氮法测定其蛋白含量。根据测定结果，用,0.9,NaCl,溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白含量为,2mg/ml,，将,2mg/m