病毒包装与感染课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病毒包装与感染,基因载体系统,病毒载体系统,非病毒载体系统,腺病毒载体,逆转录病毒载体,腺相关病毒载体,单纯疱疹病毒载体,慢病毒载体,裸,DNA,DNA-,阳离子脂质复合物,DNA-,蛋白质复合物,细胞内包装,细胞外包装,DNA-,阳离子多聚物,DNA/RNA,嵌合物,基本概念：,即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工具，将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性，将外源基因导入特定细胞中，广泛应用于基因诊断和基因治疗。,病毒载体系统,病毒载体的优势,利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；,病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性；,病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；,复杂的装配过程由细胞完成；,不同的病毒载体具有不同的表达特点；,通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；,病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产,存在的问题,1,、安全性：,细胞毒性,染色体毒性,免疫毒性,2,、靶向性：,转导靶向性,转录靶向性,3,、有效性：,转导效率,基因表达水平和持续时间,表达的可调控性,要求：,1,、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒,2,、介导外源基因转移和表达,3,、对机体不致病,组成：,1,、病毒复制和包装元件,2,、病毒基因,3,、插入的外源基因或元件,4,、病毒外壳,/,外膜,常用的病毒载体：,腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体,被包装的,DNA/RNA,中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳,/,外膜和感染性，但不表达病毒蛋白,腺病毒载体,慢病毒载体,逆转录病毒载体,病毒基因组成,双链,DNA,单链,RNA,单链,RNA,病毒原型,人,5,型腺病毒,(Ad5),人类免疫缺陷,I,型病毒,(HIV),莫洛尼鼠白血病病毒,(MMLV),可容纳外源,片段大小,8 kb,8 kb,6 kb,基因整合功能,病毒基因组游离于宿主基因,组外，瞬时表达外源基因,病毒基因组整合于宿主基因,组，长时间、稳定表达外源,基因,病毒基因组整合于宿主基因组，,长时间、稳定表达外源基因,表达丰度,高,中,中,表达时间,快,(1-2,天,),慢（,2-4,天）,快（,1-2,天）,感染细胞类型,分裂和不分裂细胞,分裂和不分裂细胞。适用于,难转染细胞,感染分裂细胞，在干细胞中表,达效率低,滴度,TU/ml,10,12,10,9,/10,10,10,9,/10,8,毒性作用,细胞毒性,遗传毒性,遗传毒性,腺病毒载体,慢病毒载体,逆转录病毒载体,免疫原性,高免疫原性,低免疫原性,低免疫原性,安全系数,高,高,中,MIRCORNA,可以,可以,不可以,RNAi,病毒进入细胞往往引起细胞内干扰素反应，不适合做,RNAi,实验,适合，是,RNAi,实验的优选工具,可以用作,RNAi,实验,基因过表达,包装容量较大。可以满足较大基因的包装，是过表达基因的优选工具,包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响,包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响,优势,几乎可以感染所有类型细胞，病毒滴度高，感染宿主范围较广，生物安全性高,适合体内实验中难于转染的细胞如神经元细胞、干细胞和其它原代细胞,外源基因表达水平较高，可实现目的基因的稳定长期表达,常见应用,1,、体外细胞基因转导,2,、基因治疗,1,、体外细胞基因转导,2,、基因治疗,1,、体外细胞基因转导,2,、全基因组插入失活突变筛选,3,、功能基因库构建,腺病毒载体,无包膜的线状双链,DNA,病毒，宿主范围很广，适用于在,分裂,或,非分裂,哺乳动物细胞中进行高效瞬时表达。,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，腺病毒系统可以在,任何哺乳动物细胞,中高效瞬时表达，是可靠的基因递送平台。它在感染宿主细胞时，病毒基因组及其携带的外源基因,独立于宿主基因组外游离表达,，因此是无插入突变性，安全性高。,腺病毒载体的外源基因装载量较大，表达速度快，可获得高滴度的病毒。可产生,10,8,pfu/ml,原液，浓缩后可达,10,10,-10,11,VP/ml,，被广泛应用于基础研究和基因治疗中。,腺病毒系统的包装,目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒（,Pshuttle-CMV,）,将穿梭质粒线性化后与腺病毒质粒共转入特定的大肠杆菌中,通过,Cre/loxP,系统的作用进行同源重组，产生重组腺病毒颗粒。,将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法转染到,293,细胞中，利用带有,E1,基因的,293,细胞作为包装细胞，一至两周即可包装出,E1,缺失的腺病毒载体，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。,慢病毒载体,慢病毒,(lentivirus),属于逆转录病毒科,(Retrovidae),，为,RNA,病毒。,慢病毒核蛋白质前整合复合物具有嗜核特性，病毒基因组通过顺式作用元件运输至细胞核，并将要表达的基因序列整合到细胞的基因组中，从而使慢病毒可以感染并在非有丝分裂细胞中复制,得到持续稳定的高表达。,这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。,慢病毒载体的特性,慢病毒载体由慢病毒为骨架改造而来,可以高效率将目的基因,整合到宿主细胞的染色体,上,可以,感染分裂细胞和非分裂细胞,是理想的可以在多种细胞类型（如原代细胞、干细胞和非分裂细胞）中实现,可重复的稳定表达,的基因表达工具,常见的慢病毒包括,人免疫缺陷病毒,(Human immunodeficiency virus,HIV),、,猴免疫缺陷病毒,(Simian immunodeficiency virus,SIV),、,马传染性贫血病毒,（,Equine infectious anemia virus,EIAV,）和,猫免疫缺陷病毒,（,Feline immunodeficiency virus,FIV,）。,HIV-1,HIV-1,为单链,RNA,病毒，共有,9,个基因。,gag,、,pol,、,env,3,个基因编码病毒的基本结构，,tat,、,rev,为调节基因，,vif,、,vpr,、,vpu,、,nef,4,个为辅助基因，编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。,gag,-群抗原基因，编码核心蛋白,基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等,pol,-,多聚酶基因，编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶,env,-,包膜蛋白基因，编码包膜蛋白,gp120,及,gp41,，决定病毒感染宿主的靶向性,tat,-,基因反式激活因子，参与,HIV-1,基因,RNA,转录的控制,rev,-,病毒蛋白表达调节因子，能增加,gag,和,env,基因对结构蛋白的表达,vif,-,病毒感染因子,其作用是在一些细胞因子的协下促进,HIV-1,在细胞内复,Vpr,-R,蛋白能使,HIV,在巨噬细胞中增殖,vpu-U,蛋白，能促进,HIV,从细胞膜上释放,nef,-,负因子，具有抑制,HIV-1,增殖作用,LTR-,两端长末端重复序列，内含复制所需的顺式作用元件，如包装信号元件,。,慢病毒载体系统组成,第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。该系统由,包装质粒,、,包膜质粒,及,载体质粒,3,种质粒组成。,包装,部分,HIV-1前病毒基因组,去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件,5,端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3,LTR由SV40 polyA序列取代,。,包装载体,表达载体部分,与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的,HIV-1,顺式作用元件,5,端,LTR,和全部,5,端非翻译区域。,包膜表达质粒,使用水疱性口炎病毒糖蛋白,G,基因,(VSV-G),用来代替了原病毒的,env,基因。,表达载体,包膜载体,三代慢病毒载体,第二代慢病毒载体系统,是在第一代的基础上进行改进,在包装质粒中删除了,HIV,的所有辅助基因（,vif,、,vpr,、,vpu,和,nef,）,不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性,第三代慢病毒载体系统,由,四质粒,代替原有的,三质粒,包装系统。,将,rev,基因单独放在一个包装质粒上。,增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了,U3,区的,3LTR,，使载体失去,HIV-1,增强子及启动子序列；二是去除了,tat,基因，用异源启动子序列代替，只保留了,3,个基因,(,gag,、,pol,和,rev,),，更加安全。,lentivirus,包装流程,将,293T,细胞传代至,60%70%,汇合时，用脂质体法将,4,个质粒共转染至细胞。,体外培养,24,小时，荧光显微镜下观察，大量细胞表达绿色荧光蛋白，说明质粒转染成功。,培养,48,小时后，用超速离心收获含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。并进行感染,293T,细胞的实验，感染,4872,小时后观察到约有,70%,细胞表达绿色荧光蛋白，说明病毒用很强的感染能力。,将被感染细胞传代,1,、,2,和,3,次，在传代细胞中依然观察到绿色荧光蛋白的表达，说明包装的慢病毒具备感染和稳定转化宿主细胞的能力。,逆转录病毒载体,逆转录病毒即反转录病毒是一类,RNA,病毒，它能在逆转录酶的作用下将,RNA,反转录为,cDNA,，再经过,DNA,复制,/,转录,/,翻译等蛋白酶作用扩增形成病毒。,逆转录病毒的,DNA,基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒,DNA,的整合是复制病毒,RNA,的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间，逆转录病毒,DNA,基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制,。,逆转录病毒载体的特点,优点,：,转染范围广，由于逆转录病毒的受体分布广泛，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等,;,转入的外源基因可完全稳定整合到宿主细胞染色体内，使得目的基因长期稳定表达；,对细胞感染率高,感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。,局限性：,只能感染分裂细胞；,能够插入的外源基因较小，难以满足较大基因的转移；,载体,DNA,整合人宿主染色体是随机的，并因随机整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，从而具有引发癌症的风险；,活体直接基因转移对病毒滴度要求高，病毒活体直接注射会受到补体影响而灭活等问题。,逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：,单嗜性逆转录病毒（,ectropic retrovirus,），只感染小鼠和少数几个品种的大鼠,兼嗜性逆转录病毒（,amphotropic retrovius,），能感染小鼠的细胞，也能感染其他种属动物的细胞,异嗜性逆转录病毒（,xenotropic retrovirus,），能感染多种动物细胞，但不能感染小鼠细胞,目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒，即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。,逆转录病毒载体包装原理,早期逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和逆转录病毒表达载体。逆转录病毒载体中去除了病毒颗粒形成所必需的,gag,，,pol,和,env,基因，仅保留了复制和包装信号。通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上。而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白,gag,、,pol,和,env,蛋白。,当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体