间充质干细胞的传代课件

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验四 间充质干细胞的培养及鉴定,一、实验目的,1、,掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。,2、,熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。,3、,掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。,4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导分化的方法。,二、实验材料、试剂与器材,1,材料：,100-150,g SD,大鼠。,2,试剂：乙醚，,75%,酒精，,L-DMEM,低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，,Percoll,细胞分离液，,1.5,M,NaCl,溶液，,0.25%,胰酶，,FITC,标记的羊抗鼠,CD29,抗体，,FITC,标记的羊抗鼠,CD90,抗体，,FITC,标记的羊抗鼠,CD71,抗体，,PE,标记的羊抗鼠,CD106,抗体，,FITC,标记的羊抗,CD45,抗体，,-,甘油磷酸钠，地塞米松，维生素,C,，,Hoechst33258,，,油红,O,，,20 g/L,硝酸钴溶液，,20,g/L,硫化铵，,50%,甘油，多聚赖氨酸（,PLL,）。,3,仪器：,细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，,pH,计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。,三、实验原理,间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中,MSCs,的含量很低，约为,0.01%,。分离间充质干细胞的方法主要有三种：全骨髓贴壁培养法；密度梯度离心法；根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离心法，即利用,Percoll,将大部分造血细胞和单个核细胞分离、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得,MSC,的纯度达到,90%,左右。,间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达,CD29,、,CD44,、,CD71,、,CD90,等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。本实验选择了,CD29,、,CD44,、,CD90,、,CD71,、,CD106,和,CD45,进行检测。,间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞等。,（一）骨髓间充质干细胞的原代培养,1.,取体重,100-150,g,的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，,75%,的酒精浸泡消毒,5,min,。,2.,将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大,”,字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有,75%,酒精的烧杯中，移入超净台。,3.,将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入,10,ml PBS,缓冲液，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。,4.将剥离干净的骨头用少量,PBS,冲洗后，放入另一培养皿，加入,12,ml DMEM,完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用,2,ml,注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。,5.,另取一干净离心管,A,，,加入,10,ml,Percoll,分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜,30,o,缓缓加入，切记不能冲破,Percoll,分离液面，用,8,ml DMEM,完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管,A,。,6.25003000 r/min,，,离心,30,min,后，可见离心管,A,中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管,B,，,切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。,7.,将,20,ml PBS,加入离心管,B,，,反复吹打混匀，,1800,r/min,离心,10,min,。,8.,弃上清，重复步骤,7,。,9.弃上清，加入,5,ml,完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。,【实验结果与分析】,每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。,【,思考题,】,1,、密度梯度离心法的原理是什么？,2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方面是需要注意的？,(二,),间充质干细胞的传代、冻存及复苏,1.,当细胞融合度达到,90%,左右时，将培养液吸出，加入,PBS,冲洗细胞两次。,2.,加入,0.25%,的胰酶,2,ml,，,置于,37,培养箱中,23,min,，,取出在显微镜下观察，当,8090%,的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。,3.,传代：加入,3,ml DMEM,完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，,1200,r/min,，,离心,10,min,。,弃上清，加入,10,ml,培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。,4.冻存：加入,3,ml DMEM,完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，,1200,r/min,，,离心,10,min,。,弃上清，加入,1,ml,冻存液（,FCS,：,DMSO,：,L-DMEM=2,：,1,：,7,）,吹打混匀，置于冻存管中,，,4,放置,3040,min,，,-20,放置,1,h,，,-80,过夜，再移入液氮罐中,。,1.,复苏：,1),将细胞从液氮中取出，,37,轻微摇晃，使细胞快速融化。,2)75,酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入,5,ml,培养基，,1000,r/min,离心,5,min,。,3）弃上清，加入,5,ml,完全培养基混匀细胞，接种于,25,cm,2,培养瓶中。,【实验结果与分析】,试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及各环节的注意事项。,【思考题】,1、,细胞传代培养的目的是什么？,2、,细胞冻存与复苏的原则是什么，怎么操作？,冻存液的成分以及作用是什么？,（三,）,BMSCs,鉴定,1,BMSCs,表面抗原鉴定：,1,）,2222,mm,盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗,10,次，三蒸水冲洗,3,次，浸泡于,75%,酒精中备用。,2,）包被时取出,75%,酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入,35,mm,2,培养皿中，吸取,0.5,ml,浓度为,50,g/m,l,的,多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，,37,放置,1,h,，,回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射,30,min,后在超净工作台内内晾干。,3,）将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于,35,mm,2,培养皿中，将第,5,代,BMSCs,用,0.25%,胰酶消化，按,110,5,/,ml,密度接种，,37,、,5%,CO,2,条件下培养。,4,）待细胞,70%,汇合时细胞去除培养基，进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原,CD29,、,CD34,、,CD45,、,CD71,、,CD90,、,CD106,的表达。用,PBS,清洗，加入,4%,多聚甲醛固定，,4,过夜。,PBS,洗,3,次后，分别滴加用,PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+,TritonX,-100(0.2%),稀释的单克隆抗体孵育，室温,90,min,。,PBS,洗,3,次。细胞核用,Hoechst 33258,染色，室温放置,5,min,并冲洗。用,50%,甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照。,【实验结果与分析】,观察表面抗原的免疫荧光染色结果：,【思考题】,1、,免疫荧光染色的步骤是什么，需要注意什么？,2、怎样用荧光显微镜拍摄荧光照片？,A,.,第五代骨髓间充质干细胞的形态学特征：,长梭形（黑色箭头）和扁平形（红色箭头），,Bar=50 m,B-H,.,第五代,BMSCs,的免疫荧光鉴定结果（蓝色为,Hoechst 33258,染色，显示细胞核）,2,、,BMSCs,的诱导分化,1)成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以,4103/,cm2,的接种密度培养在,35,mm,培养皿里，待细胞融合后将含,10%,NCS,的低糖,DMEM,生长培养液换为成脂肪分化诱导液（高糖,DMEM+10%,血清,+10,g/ml,胰岛素,+1,M,地塞米松,+100,M,吲哚美辛,+0.5,mM,3-isobutyl-1-,methylxanthine,）,培养，每隔,3,d,换诱导液一次，持续诱导培养,6,d,。,然后用维持液（高糖,DMEM+10%,胰岛素）继续培养细胞,3,d,。,各组细胞用,PBS,冲洗,3,次，,4%,多聚甲醛固定,10,min,，,油红,O,工作液浸染,10,min,，,60%,异丙醇洗去多余染液，,PBS,冲洗,3,次，苏木精复染,3-5,min,，,PBS,漂洗,10,min,。,镜下观察并摄影。,2)成骨诱导：将骨髓间充质干细胞以,410,3,/,cm,2,的接种密度培养在,35,mm,培养皿里，,12,h,后将含,10%,NCS,的低糖,DMEM,生长培养液换为成骨诱导液培养，每隔,3,d,换诱导液一次，持续诱导培养,30,d,后用钙钴染色鉴定成骨细胞。取成骨诱导,30,d,的,BMSCs,，,弃培养基，,PBS,洗,3,次，置,95%,乙醇固定液中固定,10,min,凉干。置基质液中，,37,孵育,4,6,h,（,防止水分蒸发）。取出放入,20,g/L,硝酸钴溶液中,5,min,，,流水冲洗，加入,20,g/L,硫化铵（新鲜配制）溶液中作用,5,min,。,流水冲洗，伊红复染,5,min,，,冲洗、晾干镜检。,【实验结果与分析】,A,.,BMSCs,成骨诱导后的钙钴染色结果，,Bar=50 m,；,B,.,BMSCs,成脂肪诱导后的油红染色结果，,Bar=50 m,【思考题】,1、,试述间充质干细胞成脂诱导、成骨诱导的方法。,2、成脂、成骨诱导分化后，怎样进行染色鉴定？,