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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、基础知识,（一）、,PCR,技术的概念,是一种,体外迅速扩增,DNA,片段的技术，它能以极少量的,DNA,为模板，在几小时内复制出上百份的,DNA,拷贝,（二）、,PCR,技术的应用,遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和,DNA,序列测定,1,细胞内,DNA,复制条件分析：,条件,组分,作用,模板,DNA,的两条单链,提供复制的模板,原料,四种脱氧核苷酸,合成,DNA,子链的原料,酶,解旋酶,DNA,聚合酶,打开,DNA,双螺旋,催化合成,DNA,子链,能量,ATP,为解螺旋和合成子链,供能,引物,RNA,为,DNA,聚合酶提供合成的,3,端起点,解链方向,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,3,端,延伸,DNA,链。,因此，,DNA,复制需要引物。,2,、,DNA,合成的方向,（,1,）,DNA,单链两端的命名,基本单位脱氧核苷酸,1,号碳,5,号碳,3,号碳,一个核苷酸上的,磷酸基团上的,“,OH,”,和,另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,3,5-,磷酸二酯键,。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,5-,磷酸二酯键,彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,的,羟基,“,OH,”,末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端,一个核苷酸上的,磷酸基团上的,“,OH,”,和,另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,3,5-,磷酸二酯键,。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,5-,磷酸二酯键,彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,的,羟基,“,OH,”,末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端,A,T,G,C,A,T,G,C,3,端,3,端,5,端,5,端,一个核苷酸上的,磷酸基团上的,“,OH,”,和,另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,3,5-,磷酸二酯键,。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,5-,磷酸二酯键,彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,的,羟基,“,OH,”,末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端,A,T,G,C,A,T,G,C,DNA,的反向平行结构：,1,通过,3,5-,磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：,2,、,DNA,分子两条,反向平行,的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成,氢键,连接而成。,3,端,3,端,5,端,5,端,DNA,的反向平行结构：,1,通过,3,5-,磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：,2,、,DNA,分子两条,反向平行,的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成,氢键,连接而成。,解链方向,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,引物：一小段单链,DNA,或,RNA,，,一般,20,30,个碱基,，能与,DNA,母链的一段碱基序列互补配对。,后续加工：,DNA,聚合酶,I,将,引物切去,，并合成空缺处的,DNA,单链，再由,DNA,连接酶将不连续的,DNA,子链连接起来,DNA,聚合酶不但能够催化,磷酸二酯键的形成,，还具有,校对,功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合。,思考,DNA,分子能准确复制的原因有哪些？,DNA,双螺旋结构提供模板；,碱基互补配对；,DNA,聚合酶的复查功能。,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，,只能从,3,端延伸,DNA,链,。,DNA,合成的方向,从子链由,5,端向,3,端延伸,解链方向,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,3,端延伸,DNA,链。,DNA,合成的方向从子链由,5,端向,3,端延伸,3,、,DNA,复制的前提,是,_,用,_,方法,思考：,DAN,复制的前提是什么？体外扩增,DNA,如何打开双链？,双链的解开,控制温度,DNA,双链,单链,变性（加热,80-100,）,复性（,缓慢冷却,）,4,、,DNA,分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于,引物,和引物,与两条单链的结合,PCR,的反应过程,-,DNA,分子的热变性原理,变性：在,95,时,DNA,解旋,复性：在,55,时引物与,DNA,单链结合,延伸：在,72,时合成,DNA,子链（,两个引物间的序列,）,思考：高温使,DNA,解旋，但普通,DNA,聚合酶会失活,_,找到耐高温,DNA,聚合酶,P21,托马斯,.,布鲁克,5,、体外,DNA,复制的条件,(,PCR,反应的条件,),DNA,模板；,分别与两条模板链相结合的两种,引物；,四种脱氧核苷酸；,耐高温的聚合酶；,控制温度，但不需解旋酶,.,二、,PCR,的反应过程,以便增加大分子模板,DNA,彻底变性,的概率,1,、循环之前的一次,预,变性,2,、,PCR,一般要经历,三十多,次循环,循环数,变性,复性,延伸,第一次,94C,，,5min,30,次,4,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最后一次,4,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,（,1,）,变性,：当温度上升到,90,以上时，双链,DNA,解聚为单链。,（,2,）,复性,：温度下降到,50,左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链,DNA,结合。,（,3,）,延伸,：温度上升到,72,左右，溶液中的四种脱氧核苷酸,(A,，,T,，,C,，,G),在,DNA,聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的,DNA,链。,二、,PCR,的反应过程,3,、每个循环包括,：,变性,复性,延伸,（,1,）,PCR,循环,-,变性,95,变性,（,1,）,PCR,循环,-,变性,95,变性,（,1,）,PCR,循环,-,变性,95,变性,（,2,）,PCR,循环,复性,55,复性,（,3,）,PCR,循环,延伸,（,3,）,PCR,循环,延伸,（,3,）,PCR,循环,延伸,（,3,）,PCR,循环,延伸,5,5,5,3,3,3,5,3,5,3,3,5,引物,和引物,不同,4,、循环特点：,上一次循环的,产物,为下一循环的,模板,结果单链中最初母链有,两条,其它子代,DNA,分子都为,双引物,分子,处于两引物之间的,DNA,序列呈指数增长,2,N,二、实验步骤：,准备好,PCR,反应体系的配方,P62,用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁,离心,10,分钟,将离心管放入,PCR,仪上，设置好循环程序,电泳检测,PCR,结果,三、操作提示：,操作提示,1,为,避免外源,DNA,等因素的污染,，,PCR,实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行,高压蒸汽灭菌,。,2,PCR,所用的缓冲液和酶应,分装成小份,，并在,-20,储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在,冰块上缓慢融化,。,3,在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的,枪头都必须更换,。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，,用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀,，再将微量离心管放在离心机上，离心约,10s,，使,反应液集中在离心管底部,，再放入,PCR,仪中进行反应。,目的：,避免,外源性,DNA,大量扩增造成,假阳性,反应。,录像,实验操作步骤：,（,1,）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（,准备,）,（,2,）用,微量移液器,按配方在,微量离心管,中依次加入各组分（,移液,）,（,3,）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（,混合,）,（,4,）将微量离心管放在离心机上（,离心,）,（,5,）将离心管放入,PCR,仪上，设置好,PCR,仪的循环程序（,反应,）,四、结果分析与评价,1,、原理：,DNA,在,260nm,的,紫外线,波段有一强烈的,吸收峰,(,图,5-11),。可以利用,DNA,的这一特点进行,DNA,含量的测定。,四、结果分析与评价,(,了解,),2,、具体方法如下。,1,）将样品进行,50,倍,稀释：取,2,LPCR,反应液，加入,98,L,蒸馏水。,2,）以,蒸馏水,作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计,(,图,5-12),的读数,调节至零,。,3,）加入步骤,1,中的,DNA,稀释液,100L,至,比色杯,中，测定,260nm,处的光吸收值。,4,）根据下面的公式计算,DNA,含量。,DNA,含量,(,g/ml)=,50,x(260nm,的读数,)x,稀释倍数,理论上,DNA,扩增数目的计算,1,、,一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,2,n,2,、,a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,a2,n,PCR,优点：,原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作,复习：,PCR,技术与体内,DNA,复制的区别：,1.PCR,不需要解旋酶；体内,DNA,复制需要；,2.PCR,需要耐热的,DNA,聚合酶（常用,TaqDNA,聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3.PCR,一般要经历三十多次循环，而生物体内,DNA,复制需要生物体自身的复制。,2.,过程,高温,变性,（,94,）,低温,复性,（,55,）,中温,延伸,（,72,）,多次重复,
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