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Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,鼠疫检测新技术新方法,第一页，共35页。,一、核酸检测技术,（,PCR,检测）,二、标记检测技术,（,ELISA,，胶体金）,第二页，共35页。,一、核酸检测技术,定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。,核酸的分离与纯化,内容：聚合酶链式反应,(PCR,技术,),核酸杂交技术,第三页，共35页。,核酸的纯化与分离,目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。,破碎细胞（细菌）,技术流程 核酸提取,核酸纯化,第四页，共35页。,材料的前处理,细胞破碎，核酸释放,核酸分离、纯化,沉淀或吸附核酸，去除杂质,核酸溶解缓冲液,第五页，共35页。,全自动核酸、蛋白提取仪,第六页，共35页。,聚合酶链式反应（,PCR,技术）,简史,：,1971,年，,Khorana,提出：,DNA,变性后，与合适引物进行杂交，在,DNA,聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆,tRNA,基因。,1985,年，,Mullis,等人,发明聚合酶链反应（,PCR,），,随后，,Mullis,所属公司,PE,推,出第一台,PCR,自动化热循环仪。,第七页，共35页。,基本原理：,第八页，共35页。,基本步骤,第九页，共35页。,第十页，共35页。,实时定量,PCR,仪,PCR,仪,第十一页，共35页。,凝胶成像系统,凝胶电泳系统,第十二页，共35页。,PCR,结果判定（凝胶电泳）,第十三页，共35页。,PCR,类型：,1.,多重,PCR 2.,巢式,PCR 3.,定量,PCR 4.,反向,PCR 5.,逆转录,PCR,第十四页，共35页。,PCR,技术在鼠疫检测中的应用,鼠疫菌,PCR,检测法：,从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌,fra,和,pla,基因片段作为,PCR,扩增目的片段,。,鼠疫判定标准：,PCR,扩增（,fra,+,pla,）,+,胶体金抗原检测,or,酶联免疫吸附试验,or,反相血凝试验,=,确诊鼠疫,第十五页，共35页。,鼠疫菌核酸检测样本处理,样本类别,1.,鼠疫菌培养物,2.,鼠疫病人血液、痰液或尸检标本,3.,自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）,4.,媒介昆虫,第十六页，共35页。,样品处理方法,1.,煮沸法,2.DNA,提取试剂盒,3.CTAB,法,4.,氯仿抽提法,第十七页，共35页。,第十八页，共35页。,鼠疫菌,PCR,检测,反应体系,10 x buffer,dNTPs,Fra-F,（,5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3,）,Fra-R,（,5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3,）,Pla-F,（,5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3,）,Pla-R,（,5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3,）,Taq,聚合酶,待检测模板（基因组,DNA,）,去离子水,第十九页，共35页。,鼠疫菌,PCR,检测,反应程序,预变性95 5min 1个循环,变性,95,1min,退火,72,1min,延伸,72,1min,变性72 5min,30个循环,第二十页，共35页。,M 1 2 3 4 5 6,内参基因,Pla,Fra,鼠疫,PCR,检测电泳结果判定,阳性结果：内参基因,+Pla+Fra,阴性结果：内参基因,第二十一页，共35页。,核酸杂交技术,待检测,DNA,或,RNA,先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链,DNA,或,RNA,探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。,第二十二页，共35页。,二、标记检测技术,标记技术：,用,标记物,质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记,抗体（或抗原）,进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原,。,第二十三页，共35页。,标记检测特点,：,标记,免疫技术,=,免疫技术,+,标记技术,抗原抗体反应,示踪物标记,灵敏性,特异性,标记免疫技术的主要特点：,高特异性,、,高灵敏性,第二十四页，共35页。,鼠疫标记检测技术,ELISA,胶体金,第二十五页，共35页。,ELISA,技术,原理：,1.,使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.,2.,在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.,3.,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.,4.,加入底物,通过颜色变化来测定.,第二十六页，共35页。,ELISA,的类型：,间接法,第二十七页，共35页。,双抗夹心法,第二十八页，共35页。,ELISA,技术在鼠疫检测中的应用,1.,检测鼠疫,F1,抗原（,or,抗体）,原理,：,以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。,所需试剂及器材：,HRP-F1McAb,冻干剂，,F1McAb,包被板，鼠疫,F1,阳性对照、阴性对照，,PBS,（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（,2M,硫酸）。,ELISA,检测工作站，,ELISA,洗板机、振荡器等,第二十九页，共35页。,第三十页，共35页。,第三十一页，共35页。,ELISA,结果判读,：,1.,目测：,平持反应版，距白色背景,5-10cm,，从板的正上方观察。,（,+,）深黄棕色；,（,+,）浅黄棕色；,（,+,）颜色明显可见；,（,-,）无色或颜色很浅,2.ELISA,检测工作站,标本,OD/,阴性,OD2.1,位阳性。,第三十二页，共35页。,ELISA,操作注意事项,：,（,一）,加样,加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染,。,（二）,保温,在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡,。,为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中,。,第三十三页，共35页。,（,三）,洗涤,洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次,。,（四）,显色和比色,显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间,。,第三十四页，共35页。,胶体金检测技术：,原理,：,将F1-McAb抗体以条带状固定在NC 膜上，胶体金标记F1-McAb吸附在结合垫上，与待测样品反应，通过目测的胶体金标记复合物得到直观的显色结果。,检测类别,：,第三十五页，共35页。,
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