微丝染色及形态观察

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目的要求,1.掌握微丝的染色方法。,2.了解光镜下微丝的基本形态结构。,3.了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。,微丝染色及形态观察,实验原理,真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。,当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。,应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。,微丝在细胞内的分布特征,实验用品,器具：CO,2,恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。,材料：盖玻片培养的成纤维细胞,试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1TritonX-100溶液、M-缓冲液、3戊二醛固定液、0.2考马斯亮蓝染液、100g,/ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。,实验步骤,1.培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于37、5%CO,2,的温箱中生长24h,48h。,（设正常生长组和细胞松弛素B处理组）,2.染色处理,（1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一角轻轻滴加3,4滴），洗去表面的培养液。,（2）抽提 吸弃PBS，加入1%Triton X-100液4-5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理25,30min（或置3718min）。,（3）稳定 吸弃Triton X-100，立即用M-缓冲液轻,轻地洗涤3次，每次3min。,（4）固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，,再以PBS液洗3次，洗去固定液。,（5）染色 滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色20,30min，然后小心的用自来水漂洗。,（6）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水,纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。,实验结果,光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。,1光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）。,2注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别。,3观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常。,光学显微镜下微丝分布图,注意事项,1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。,2.恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理,前的状态。,3操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。,4染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。,5TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过,长而导致细胞结构的破坏。,作业与思考题,1比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？,2实验中设计对照组的作用及重要性？,3TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯,亮蓝在本实验中所起作用？,