流式细胞仪讲义

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术,实验结果,的质控,获得流式细胞术实验结果必须经历以一下步骤：,1、检测样本的获得,2、抗体染色与洗涤,3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析,影响流式细胞术实验结果的,主要因数:,一、仪器的可变性。,二、标本的可变性。,三、操作过程的可变性。,四、数据分析的可变性,1、流式细胞仪需要质控的部件,a、激发光路：,（激光器、棱镜、透镜）,b、发射光路：（透镜组合滤片）,c、电子线路：（光检测器、高压供给器、放大器、,补偿线路、模数转换器）,d、流路系统：（流动室、样品流、进样针、鞘液流）,一、仪器的可变性。,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,流式细胞仪的液流系统,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：,A、校正激发、发射光路,B、监控检测器的灵敏度(cv),C、监控仪器电子线路的稳定性,二、标本的可变性,1、标本的采集和固定方法的质控,2、单细胞悬液制备的质控,3、石蜡包埋组织单细胞制备的质控,4、脱落细胞样品的采集的质控,1、标本的采集和固定方法的质控,A、取手术切除新鲜标本或活检针吸标本时，避免出血或取材坏死组织。,B、标本采集后要及时固定,C、固定剂的浓度：以对组织细胞穿透性强的为佳,2、单细胞悬液制备的质控,1、没有连结装组织：培养细胞、血液、骨髓等,2、新鲜实体组织：（酶学、化学、机械方法）,3、石蜡包埋组织：（切片厚度、脱蜡、水化、,单细胞制备）,4、脱落细胞样本的采集：（杂质、团块、重叠,细胞少于2%，）,三、操作,（试剂方法）,过程的可变性,1、温度对荧光染色强度的影响（温度淬灭）,2、荧光燃料浓度与荧光强度的关系（浓度淬灭）,3、PH值对荧光强度的影响,4、其他一些影响荧光强度的因数（醛类固定剂、,溶剂中不发光物质如：卤化物、氨基酸、铁 等）,四、数据分析的可变性,1、设门,2、阴、阳细胞的分界线,实验条件对流式细胞术分析结果的影响,1、低渗处理,2、未固定细胞样品染色后存放时间,3、设门,A、设一个门分析多种参数,B、设多个门分析某一种参数,4、在DNA含量分析时（二联体细胞）,1、低渗处理,低渗处理前正常外周血细胞DNA直方图,低渗处理5H后正常外周血细胞DNA直方图,G0/1峰左侧有明显细胞碎片峰,2、未固定细胞样品染色后存放时间,染色后立即检测样品,染色后置4,0,C5H后检测样品,3、设门,A、设一个门分析多种参数,散射光图（R1设定细胞为淋巴细胞）,左上限：CD3,-,/CD(16+56),+,荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE),右限：CD(16+56),+,细胞（少）,右限：CD3,+,细胞（多）,荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE),B、设多个门分析某一种参数,荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE),荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE),荧光标记：FL1:CD71.177,B、设联动门分析某些参数,4、二联体细胞对DNA含量分析的影响,鉴别DNA直方图中凋亡细胞与DNA异倍体G0/1期细胞峰,在DNA直方图上，靠近二倍体G,0/1,期细胞峰前出现一个亚峰二倍体细胞峰，它是DNA异倍体细胞峰，还是凋亡峰？可用半胱氨酸蛋白酶3与样品细胞作用后，当半胱氨酸蛋白酶3+率增高时，该细胞峰为凋亡峰，当半胱氨酸蛋白酶3+率很低时，该细胞峰可能是低DNA二倍体的异倍体细胞G,0/1,期细胞峰.,在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF)与DNA 异倍体,G,0/1,细胞峰,在DNA直方图上，二倍体,G0/1,细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期分析，若SPF比率与CD71,+,细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF比率显著高于CD71,+,细胞检出率时，则该右肩峰可能为DNA异倍体细G,0/1,峰。,在DNA直方图上细胞凋亡和细胞坏死比较分析,谢谢!,