透射电镜样本的制备

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,透射电镜样本的制备,超薄切片制样,负染,超薄切片,由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。,1957,年，英国,Huxley,发明超薄切片机。,超薄切片制片过程,取材,取材具体方法,将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。,用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。,将组织切成细长条，再将其切成小块（,1mm,3,）。,将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。,若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置于,4,冰箱内固定。,固定,目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。,固定方法,化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定,物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定,灌注固定,通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。,适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定。,理想固定剂,常用固定剂,固定方法戊二醛-锇酸双固定,先用,2.5%,戊二醛固定,2h,以上。,缓冲液多次清洗（,pH7.4 0.2mol/L,磷酸缓冲液洗三次，,15min/,次）。,1%,锇酸固定,2h,。,清洗,组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液,残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。,锇酸可与乙醇作用生成沉淀。,清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）,脱水,去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备,常用脱水剂,乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。,丙酮,市售的无水丙酮含少量水分，可加入,无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。,脱水,100%,丙酮,H2O,50%,丙酮,H2O,90%,丙酮,H2O,70%,丙酮,15min,15min,15min,20min,20min,浸透和包埋,通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去,以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的作用，有利于超薄切片。,丙酮：包埋剂,2,：,1,371h,丙酮：包埋剂,1,：,1,371h,纯包埋剂,371h,包埋,37,过夜，,4524h,，,6524h,理想包埋剂,Epon812,：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。,Epon812,DDSA,（十二烷基琥珀酸酐）,固化剂：控制软度,MNA,（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐）,固化剂：控制硬度,DMP-30,（,2,4,6,三，二甲氨基甲基苯酚）,加速剂,包埋剂配方,季节配比,包埋液成份,5mL,10mL,20mL,30mL,40mL,50mL,春秋,Epon812,2.495,4.99,9.98,14.97,19.96,24.95,DDSA,0.62,1.24,2.48,3.72,4.96,6.2,MN,A,1.885,3.77,7.54,11.31,15.08,18.85,DMP-30,0.085,0.17,0.34,0.51,0.68,0.85,夏,Epon812,2.57,5.14,10.28,15.42,20.56,25.7,DDSA,0.31,0.62,1.24,1.86,2.48,3.1,MN,A,2.12,4.24,8.48,12.72,16.96,21.2,DMP-30,0.085,0.17,0.34,0.51,0.68,0.85,冬,Epon812,2.425,4.85,9.7,14.55,19.4,24.25,DDSA,0.925,1.85,3.7,5.55,7.4,9.25,MN,A,1.65,3.3,6.6,9.9,13.2,16.5,DMP-30,0.085,0.17,0.34,0.51,0.68,0.85,包埋板,切片,修块,切片,超薄切片机,机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进。,热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微小变化来推进。,判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是：,灰色,40-50,nm,分辨率高，反差小,银白色,50-70nm,金黄色,70-90nm,分辨率低，反差好,紫色,90nm,以上,电子束不易穿过,FORMVAR,膜制备,Formvar,（,PVF,）溶于纯二氯乙烯制成,0.2-0.5%,的制膜液,染色,组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。,利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。,染色剂,30min,左右,与,CO2,接触会形成不溶性碳酸铅沉淀,10min,左右,半薄切片制作,可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。,修块时，将切片修得大一些，切成,1,m,的厚片，甲苯胺蓝染色观察。,超薄切片制样程序,2-3%戊二醛固定液中,4,，,2小时或更长时间。,磷酸缓冲液漂洗,3次，每次15min。,1%锇酸,2h,磷酸缓冲液漂洗,3次，每次15min。（可4,过夜）,取材,：处死实验动物后半分钟到,1,分钟内，最多,15,分钟取出,1mm,3,的组织块,固定,：,50%丙酮,15min,70%丙酮,15min,90%丙酮,15min,100%丙酮,2次，每次20min,脱水,：,100%丙酮：Epon812=2:1,1h;,100%丙酮：Epon812=1:1,1h,100%丙酮：Epon812=1:2,1h,纯,Epon812,2-4h,浸透,：,Epon812包埋剂,35,过夜,Epon812包埋剂,45,24h,Epon812包埋剂,60,24h,包埋,：,5%醋酸铀,30min-1h。,双蒸水洗,3 次,柠檬酸铅染色,5-10min,双蒸水洗,3 次,超薄切片,：,包埋块修整成四边光滑尖端呈梯形面的锥体，切成,50-70nm,的超薄切片。,切片染色,：,负染,阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首先由,hall,在,1955,年提出。,Hall,在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的,空洞,被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质,(,如重金属盐等,),包埋,低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像,透明,地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色,负染,简单快速,可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。,病毒,负染染色剂的条件,较强的电子散射能力以产生足够的图像反差。,熔点高，在电子束的轰击下不会升华,溶解度大，不易析出沉淀。,在电镜下不呈现可观察到的结构。,分子小，容易渗入不规则表的凹陷处,与样品不起化学反应。,目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成,1,3,的溶液，使用时应用,1 mol,L,氢氧化钠溶液将负染色液的,pH,值调至,6.4,7.0,或实验所需的值。,样品要求,样品要适当提纯。不要求样品悬液的纯度很高，但杂质过多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类及各种盐类结晶的存在会干扰染色反应和电镜的观察。,样品悬液浓度适中，太稀不易找到样品，太浓样品堆积影响观察。,负染染色方法,悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色,1,2,分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗,1,2,次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。,喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用。,漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮,(,有支持膜的那面向下,),，然后再在负染色液的液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。,复习题,简述超薄切片制样步骤,负染,