转化子的筛选与重组子的鉴定(PPT35页)

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,转化子,的,的筛选,与,与重组,子,子的鉴,定,定,为什么,要,要进行,转,转化子,的,的筛选,和,和重组,子,子的鉴,定,定？,在DNA体外,重,重组实,验,验中，,外,外源DNA片,段,段与载,体,体DNA的连,接,接反应,物,物一般,不,不经分,离,离直接,用,用于转,化,化，再,加,加上重,组,组率和,转,转化率,的,的不理,想,想，因,此,此必须,通,通过筛,选,选和鉴,定,定来区,分,分转化,子,子与非,转,转化子,、,、重组,子,子与非,重,重组子,、,、期望,重,重组子,与,与非期,望,望重组,子,子。,转化子,：接纳,载,载体或,重,重组分,子,子的转,化,化细胞,。,。,非转化,子,子,：为接,纳,纳载体,或,或重组,分,分子的,非,非转化,细,细胞。,重组子,：含有,重,重组DNA分,子,子的转,化,化子。,非重组,子,子,：仅含,有,有空载,载,载体分,子,子的转,化,化子。,期望重,组,组子,：含有,目,目的基,因,因的重,组,组子。,非期望,重,重组子,：不含,目,目的基,因,因的重,组,组子。,转化子,重组子,期望重,组,组子,三者的,关,关系,转化子,的,的筛选,与,与重组,子,子的鉴,定,定方法,基于载,体,体遗传,标,标记的,筛,筛选与,鉴,鉴定,利用载,体,体DNA分子,上,上所携,带,带的选,择,择性遗,传,传标记,基,基因筛,选,选转化,子,子或重,组,组子,基于克,隆,隆片段,序,序列的,筛,筛选与,鉴,鉴定,由于基,于,于载体,遗,遗传的,筛,筛选与,鉴,鉴定程,序,序不能,区,区分期,望,望重组,子,子与非,期,期望重,组,组子。,在,在大多,数,数情况,下,下，待,克,克隆的,目,目的基,因,因或DNA片,段,段的序,列,列至少,部,部分是,已,已知的,，,，因此,根,根据克,隆,隆片段,序,序列设,计,计的筛,选,选与鉴,定,定程序,具,具有广,泛,泛的实,用,用性,基于外,源,源基因,表,表达产,物,物的筛,选,选与鉴,定,定,如果克,隆,隆在受,体,体细胞,中,中的外,源,源基因,编,编码产,物,物是蛋,白,白质，,则,则可通,过,过检测,这,这种蛋,白,白质的,生,生物功,能,能或结,构,构来筛,选,选和鉴,定,定期望,重,重组子,基于载,体,体遗传,标,标记的,筛,筛选与,鉴,鉴定,抗药性,筛,筛选法,营养缺,陷,陷性筛,选,选法,显色模,板,板筛选,法,法,噬菌斑,筛,筛选法,ROP,ROI,Sal,I,Bam,H,I,Tc,r,Pvu,I,Pst,I,Pst,I,Eco,R I,Cla,I,Hin,d,III,Hin,d,II,Bal,I,Ap,r,pBR322,4363 bp,ori,可区分,转,转化子,与,与非转,化,化子、,重,重组子,与,与非重,组,组子。,非重组,子,子：Ap,r,、Tc,r,重组子,：,：Ap,s,、Tc,s,抗药性,筛,筛选法,将外源DNA,片,片段插,入,入,BamH I,、,、Sal I,位点,将转化液涂布含Ap的平板,Ap,再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上,Ap+,Tc,影印,挑选,在Ap平板上生长、但在Ap+Tc平板上不长的转化子为重组子,基本操,作,作：,营养缺,陷,陷性筛,选,选法,基本原,理,理：,营养缺,陷,陷型筛,选,选法可,以,以区分,转,转化子,与,与非转,化,化子，,一,一般不,能,能区分,重,重组子,与,与非重,组,组子。,其,其原理,是,是：载,体,体分子,上,上携带,某,某种营,养,养组份,的,的合成,基,基因，,而,而受体,细,细胞本,身,身不能,合,合成这,一,一营养,组,组份，,将,将转化,细,细胞涂,布,布在不,含,含此营,养,养组份,的,的培养,基,基上，,长,长出的,便,便是转,化,化子,。,。,Lys,Lys,+,Lys,Lys,+,基本原,理,理图示,：,：,常见的,营,营养缺,陷,陷型筛,选,选标记,：,：,哺乳动,物,物细胞,中,中存在,两,两条dTTP,的,的合成,途,途径：,用于大,肠,肠杆菌,的,的营养,标,标记基,因,因常选,用,用色氨,酸,酸生物,合,合成基,因,因,trp,+,用于高,等,等哺乳,动,动物细,胞,胞的营,养,养标记,基,基因常,使,使用胸,腺,腺嘧啶,核,核苷激,酶,酶基因,tk,，相应,的,的受体,细,细胞则,选,选择,tk,-,缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,T,R,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP,氨,氨基,喋,喋呤,TK,胸腺嘧,啶,啶核苷,激,激酶,显色模,型,型筛选,法,法,基本原,理,理：,显色筛,选,选法可,以,以区分,转,转化子,与,与非转,化,化子，,也,也可区,分,分重组,子,子与非,重,重组子,。,。其原,理,理是：,载,载体分,子,子上携,带,带某种,显,显色酶,基,基因，,其,其表达,产,产物能,使,使细胞,产,产生颜,色,色反应,，,，从而,易,易于辨,认,认和挑,选,选，如,大,大肠杆,菌,菌质粒,pUC18,携带的,lacZ,基因（,蓝,蓝色反,应,应）、,链,链霉菌,质,质粒,pIJ702,携带的,melC,基因（,黑,黑色反,应,应）等,。,。,显色筛,选,选法的,基,基本操,作,作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap+ X-gal,重组子,（,Ap,r,+ lacZ,-,）,将外源,基,基因克,隆,隆在,pUC18,的,lacZ,标记基,因,因内部,，,，使之,灭,灭活，,此,此时重,组,组子呈,Ap,r,、,lacZ,-,，淡黄,色,色菌落,；,；而非,重,重组子,则,则呈,Ap,r,、,lacZ,+,，蓝色,菌,菌落,噬菌斑,筛,筛选法,重组子,非重组,子,子,1.取,代,代型载,体,体,噬,噬菌,斑,斑中的,噬菌体,即,即为重,组,组子。,2.插,入,入型载,体,体,根,根,据,据载体,上,上的标,记,记基因,筛,筛选。,（,（如：,lacZ,）,基于克,隆,隆片段,序,序列的,筛,筛选与,鉴,鉴定,PCR,鉴,鉴定法,菌落原,位,位杂交,法,法,限制性,酶,酶切图,谱,谱法,亚克隆,法,法,DNA,序,序列测,定,定法,PCR,鉴,鉴定法,PCR,技,技术的,两,两大主,要,要用途,为,为目的,基,基因的,获,获得和DNA,特,特定序,列,列的检,测,测。根,据,据引物,互,互补区,域,域的不,同,同，PCR技,术,术即可,用,用于区,分,分重组,子,子与非,重,重组子,，,，也能,鉴,鉴定期,望,望重组,子,子与非,期,期望重,组,组子，,甚,甚至还,能,能探测,目,目的基,因,因或DNA片,段,段是否,整,整合在,受,受体细,胞,胞的基,因,因组上,。,。上述PCR,鉴,鉴定程,序,序一般,需,需要将,筛,筛选平,板,板上的,单,单菌落,分,分别挑,出,出进一,步,步培养,，,，因此,不,不太适,用,用于成,千,千上万,个,个转化,子,子的鉴,定,定。,转化子,重,重组子,非期望,重,重组子,转化子,期,期望重,组,组子,期望重,组,组子,受体基,因,因组,非整合,子,子,整,整,合,合子,工作原,理,理：,菌落原,位,位杂交,法,法,菌落原,位,位杂交,法,法（又,称,称探针,原,原位杂,交,交法）,能,能从成,千,千上万,个,个转化,子,子中迅,速,速检测,出,出期望,重,重组子,，,，其前,提,提条件,是,是必须,拥,拥有与,目,目的基,因,因某一,区,区域同,源,源的探,针,针序列,。,。根据,核,核酸杂,交,交原理,，,，探针,序,序列特,异,异性的,杂,杂交目,的,的基因,，,，并通,过,过放射,性,性同位,素,素或荧,光,光基团,进,进行定,位,位检测,。,。,原位杂,交,交的操,作,作程序,探针的,制,制备,探针的,长,长度以,及,及与目,的,的基因,之,之间的,序,序列同,源,源性是,杂,杂交实,验,验成败,的,的关键,最佳的,探,探针长,度,度范围,为,为1001000bp,探针内,部,部不能,含,含有大,面,面积的,互,互补序,列,列，会,直,直接影,响,响探针,与,与DNA靶序,列,列的杂,交,交。,探针的,获,获取方,法,法：,1、目,的,的基因,的,的同源,序,序列,2、cDNA,3、人,工,工合成,探针的标记,探针在杂交,后,后是通过其,分,分子中的放,射,射性同位素,或,或荧光基团,进,进行定位,示踪的，放,射,射性的强弱,直,直接关系到,杂,杂交反应的,灵,灵敏度。,单位长度探,针,针标记的同,位,位素越多，,杂,杂交反应灵,敏,敏度就越高,。,。,探针标记方,法,法：,1、5端,标,标记法。,2、反转录,标,标记法。,3、缺刻前,移,移标记。,4、ABC,标,标记法。,5端标记,法,法,P,P,DTT、Mg,2+,、,-,32,PdATP,、,、过量ADP,T4-PNP酶,P,P,方法1,P,P,碱性磷酸酶,P,P,方法2,T4-PNP酶,变性制备单,链,链探针,缺刻前移标,记,记法,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,DNaseI,DNA聚合,酶,酶I,dNTP、,-,32,PdATP,变性,限制性酶切,图,图谱法,所谓的限制,性,性酶切图谱,法,法就是对载,体,体上插入的,外,外源,DNA,片段进行酶,切,切图谱分析,，,，并以此与,目,目的基因的,已,已知图谱对,比,比，因此利,用,用这种方法,不,不仅能区分,重,重组子与非,重,重组子，而,且,且还能鉴定,目,目的重组子,。,。但这种方,法,法在用于数,千,千规模的转,化,化子筛选时,，,，工作量极,大,大，实验成,本,本也高。,全酶解图谱,法,法,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子,与,与非重组子,电泳观察酶,解,解产物片段,重组子：,2.7 kb + 4.0 kb,非重组子：,2.7 kb,如果外源,DNA,片段也是,2.7 kb,，最好,选用单一切,口,口的酶将质,粒,粒线型化，,然,然,后通过其长,度,度来鉴定其,是,是否为重组,子,子,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,S,S,B,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区,分,分,重,重,组,组,子,子,与,与,非,非,重,重,组,组,子,子,如,果,果,外,外,源,源,DNA,片,段,段,插,插,pUC18,的,SphI,位,点,点,处,处,，,，,原,原,则,则,上,上,也,也,可,可,用,用,SphI,酶,解,解,鉴,鉴,定,定,，,，,但,但,这,这,样,样,做,做,很,很,不,不,经,经,济,济,，,，,因,因,为,为,SphI,非,常,常,昂,昂,贵,贵,（,（,每,每,100,单,位,位,50,美,元,元,）,）,。,。,用,用,HindIII,和,EcoRI,联,合,合,酶,酶,解,解,同,同,样,样,可,可,以,以,达,达,到,到,目,目,的,的,，,，,但,但,这,这,两,两,种,种,酶,酶,的,的,价,价,格,格,只,只,及,及,SphI,的,1/50,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区,分,分,目,目,的,的,重,重,组,组,子,子,与,与,非,非,目,目,的,的,重,重,组,组,子,子,用,EcoRI,酶,酶,切,切,转,转,化,化,子,子,质,质,粒,粒DNA,目,的,的,重,重,组,组,子,子,：,：,3.0kb+3.7kb,或,者,者,：,：1.0kb+5.7kb,用,PstI,酶,酶,切,切,转,转,化,化,子,子,质,质,粒,粒DNA,目,的,的,重,重,组,组,子,子,：,：,3.2kb+3.5kb,或,者,者,：,：0.8kb+5.9kb,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,4.0kb,2.0kb,2.0kb,区,分,分,目,目,的,的,重,重,组,组,子,子,与,与,非,非,目,目,的,的,重,重,组,组,子,子,对,图,图,示,示,的,的,克,克,隆,隆,片,片,段,段,，,，,转,转,化,化,子,子,质,质,粒,粒,DNA,用,EcoRI,酶,切,切,开,开,后,后,，,，,只,只,出,出,现,现,2.0kb,和,2.7kb,两,条,条,带,带,子,子,，,，,实,实,际,际,上,上,2.0kb,的,条,条,带,带,中,中,含,含,有,有,两,两,种,种,不,不,同,同,的,的,分,分,子,子,2.7kb,2.0kb,E,部,分,分,酶,酶,解,解,图,图,谱,谱,法,法,2.2 kb,PstI EcoRI BamHI,B,B,E,4.4 kb,1.2,1.8 kb,E,B,0.6,0.8,该,重,重,组,组,质,质,粒,粒,经,经,酶,酶,解,解,后,后,，,，,分,分,别,别,得,得,到,到,下,下,列,列,几,几,组,组,数,数,据,据,：,：,BamHI,全,酶,酶,解,解,：,：,0.60.81.83.4kb,BamHI+EcoRI,全,酶,酶,解,解,：,：,0.60.81.81.22.2kb,其,中,中,，,，,1.2kb,片,段,段,的,的,存,存,在,在,表,表,明,明,该,该,片,片,段,段,位,位,于,于,一,一,端,端,BamHI,部,分,分,酶,酶,解,解,：,：,1.42.64.0kb,其,中,中,，,，,1.4kb,的,片,片,段,段,必,必,为,为,0.6kb,和,0.8kb,两,片,片,段,段,，,，,表,表,明,两,两,者,者,是,是,连,连,在,在,一,一,起,起,的,的,；,；,同,同,理,理,，,，,2.6kb,的,片,片,段,段,必,必,为,为,0.8,kb,和,1.8kb,两,片,片,段,段,，,，,表,表,明,明,两,两,者,者,是,是,连,连,在,在,一,一,起,起,的,的,；,；,最,最,后,后,，,，,4.0kb,的,片,片,段,段,必,必,为,为,0.6kb,和,3.4kb,两,片,片,段,段,，,，,表,表,明,明,两,两,者,者,是,连,连,在,在,一,一,起,起,的,的,DNA,序,序,列,列,测,测,定,定,法,法,DNA,序,序,列,列,测,测,定,定,是,是,精,精,确,确,鉴,鉴,定,定,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,重,重,要,要,手,手,段,段,，,，,目,目,前,前,国,国,际,际,上,上,流,流,行,行,采,采,用,用Sanger,发,发,明,明,的,的,双,双,脱,脱,氧,氧,末,末,端,端,终,终,止,止,法,法,测,测,定,定DNA,序,序,列,列,，,，,其,其,工,工,作,作,原,原,理,理,是,是,在,在DNA,聚,聚,合,合,反,反,应,应,的,的,进,进,程,程,中,中,，,，,通,通,过,过,位,位,点,点,特,特,异,异,性,性,终,终,止,止,测,测,定,定,。,。,DNA,序,序,列,列,其,其,关,关,键,键,技,技,术,术,有,有,：,：,DNA,链,链,聚,聚,合,合,反,反,应,应,时,时,的,的,定,定,点,点,随,随,机,机,中,中,断,断,（ddNTP,）,）,聚,丙,丙,烯,烯,酰,酰,胺,胺,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,的,的,高,高,分,分,辨,辨,率,率,（600bp/601bp,）,）,电,脑,脑,自,自,动,动,检,检,测,测,、,、,记,记,录,录,、,、,编,编,辑,辑,程,程,序,序,用,于,于DNA,测,测,序,序,的,的,专,专,一,一,性,性,试,试,剂,剂,盒,盒,（Kit,）,）,双,脱,脱,氧,氧,末,末,端,端,终,终,止,止,测,测,序,序,法,法,的,的,基,基,本,本,操,操,作,作,：,：,A,C,G,T,ssDNA,ssDNA,ssDNA,ssDNA,Primer,Primer,Primer,Primer,Klenow,Klenow,Klenow,Klenow,dNTPs,dNTPs,dNTPs,dNTPs,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP,A,G,T,C,DNA,聚,聚,合,合,反,反,应,应,聚,丙,丙,烯,烯,酰,酰,胺,胺,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,双,脱,脱,氧,氧,末,末,端,端,终,终,止,止,测,测,序,序,法,法,的,的,基,基,本,本,反,反,应,应,：,：,Klenow,OH3,5P,T,dNTP+ddATP,T,T,T,T,T,OH3,5P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,基,于,于,外,外,源,源,基,基,因,因,表,表,达,达,产,产,物,物,的,的,筛,筛,选,选,与,与,鉴,鉴,定,定,蛋,白,白,质,质,生,生,物,物,功,功,能,能,检,检,测,测,法,法,放,射,射,免,免,疫,疫,原,原,位,位,检,检,测,测,法,法,蛋,白,白,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,检,检,测,测,法,法,蛋,白,白,质,质,生,生,物,物,功,功,能,能,检,检,测,测,法,法,某,些,些,外,外,源,源,基,基,因,因,编,编,码,码,具,具,有,有,特,特,殊,殊,生,生,物,物,功,功,能,能,的,的,酶,酶,类,类,或,或,活,活,性,性,蛋,蛋,白,白,（,（,如,如,-,淀,淀,粉,粉,酶,酶,、,、,葡,葡,聚,聚,糖,糖,内,内,切,切,酶,酶,、,、,-,葡,葡,萄,萄,糖,糖,苷,苷,酶,酶,、,、,蛋,蛋,白,白,酶,酶,、,、,抗,抗,生,生,素,素,抗,抗,性,性,蛋,蛋,白,白,等,等,）,）,，,，,设,设,计,计,简,简,单,单,灵,灵,敏,敏,的,的,平,平,板,板,模,模,型,型,，,，,可,可,以,以,迅,迅,速,速,筛,筛,选,选,出,出,克,克,隆,隆,了,了,上,上,述,述,蛋,蛋,白,白,编,编,码,码,基,基,因,因,的,的,期,期,望,望,重,重,组,组,子,子,。,。,重,组,组,子,子,利,用,用,淀,淀,粉,粉,酶,酶,基,基,因,因,表,表,达,达,产,产,物,物,检,检,测,测,重,重,组,组,子,子,放,射,射,免,免,疫,疫,原,原,位,位,检,检,测,测,法,法,基,本,本,原,原,理,理,及,及,操,操,作,作,程,程,序,序,与,与,菌,菌,落,落,原,原,位,位,杂,杂,交,交,法,法,非,非,常,常,相,相,似,似,，,，,只,只,不,不,过,过,后,后,者,者,是,是,用,用,核,核,酸,酸,探,探,针,针,通,通,过,过,碱,碱,基,基,互,互,补,补,的,的,形,形,式,式,特,特,异,异,性,性,杂,杂,交,交,目,目,的,的DNA,序,序,列,列,，,，,而,而,前,前,者,者,利,利,用,用,抗,抗,体,体,通,通,过,过,特,特,异,异,性,性,免,免,疫,疫,反,反,应,应,搜,搜,寻,寻,目,目,标,标,蛋,蛋,白,白,质,质,。,。,因,因,此,此,使,使,用,用,放,放,射,射,免,免,疫,疫,原,原,位,位,检,检,测,测,法,法,筛,筛,选,选,鉴,鉴,定,定,期,期,望,望,重,重,组,组,子,子,的,的,前,前,提,提,条,条,件,件,是,是,外,外,源,源,基,基,因,因,在,在,受,受,体,体,细,细,胞,胞,中,中,必,必,须,须,表,表,达,达,出,出,具,具,有,有,正,正,确,确,空,空,间,间,构,构,象,象,的,的,蛋,蛋,白,白,产,产,物,物,，,，,同,同,时,时,具,具,备,备,与,与,之,之,对,对,应,应,的,的,特,特,异,异,性,性,抗,抗,体,体,。,。,蛋,白,白,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,检,检,测,测,法,法,对,于,于,那,那,些,些,生,生,物,物,功,功,能,能,难,难,以,以,检,检,测,测,的,的,外,外,源,源,基,基,因,因,编,编,码,码,产,产,物,物,，,，,手,手,头,头,又,又,没,没,有,有,现,现,成,成,的,的,抗,抗,体,体,做,做,蛋,蛋,白,白,免,免,疫,疫,原,原,位,位,分,分,析,析,实,实,验,验,，,，,可,可,以,以,通,通,过,过,聚,聚,丙,丙,烯,烯,酰,酰,胺,胺,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,对,对,重,重,组,组,克,克,隆,隆,进,进,行,行,筛,筛,选,选,鉴,鉴,定,定,。,。,表,达,达,产,产,物,物,非,重,重,组,组,子,子,重,重,组,组,子,子,