霍乱实验室检测技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,霍乱弧菌实验室检测技术,北京市海淀区,疾病预防控制中心,霍乱的流行情况,霍乱的生物学性状,样本的采集,检验操作程序,荧光定量,PCR,方法检测,O1,群、,O139,群霍乱弧菌及霍乱毒素,提纲,由,O1,群、,O139,群霍乱弧菌引起的,霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征，,被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病，也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。,O1,群,霍乱,弧菌,的流行情况,1817,年,1923,年发生六次霍乱的世界大流行,均由,O1,群霍乱弧菌古典生物型引起,1820,年古典生物型引起的霍乱首次传到我国,1961,年开始了第七次霍乱的世界大流行,均由,O1,群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（,1905,年发现）,1961,年埃尔托生物型霍乱首次传到我国,O139,群,霍乱,弧菌,的流行情况,1992,年印度马德拉斯发生,O139,霍乱并迅速传播,1993,年,6,月我国新疆发现,O139,霍乱流行。,1994,年我市发现,O139,霍乱疫情,O1,群和,O139,群霍乱弧菌与其他霍乱弧菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素,弧菌的分类,形态与染色,抗原结构、血清群,生长与培养特性,生化反应特性,对外界的抵抗力,药物敏感性,霍乱的生物学性状,弧菌的分类（包括,5,个属）,弧菌属,霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等,气单胞菌属,邻单胞菌属,发光菌属,水栖菌属,霍乱的生物学性状,形态与染色,革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平,单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状,暗视野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状,培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润,霍乱的生物学性状,革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平,单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状,抗原结构、血清群,H,抗原和,O,抗原,根据,O,抗原不同，分为,200,多个血清型,根据,O,抗原成分的不同分,群特异性抗原因子,和,型特异性抗原因子,O1,群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型,小川型含,A,、,B,抗原因子，也含少量,C,因子成分,稻叶型含,A,、,C,因子,彦岛型含,A,、,B,、,C,因子,霍乱的生物学性状,生长与培养特性,好氧同时兼性厌氧，最适生长温度,37,钠离子可刺激生长,耐碱不耐酸,初次分离时常用碱性蛋白胨水,(pH8.8-9.0),增菌培养，,霍乱弧菌经,6,8h,增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜,霍乱的生物学性状,生化反应特性,两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,产酸不产气,迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖,氧化酶试验,弧菌属细菌大多为阳性,粘丝实验,弧菌属细菌大多为阳性,霍乱的生物学性状,对外界的抵抗力,在河、井、海水中可存活,13,周以上,食物和海产品上存活,7,天左右,对低温和碱耐受力强,（在食品上的弧菌于冰箱保存（,05,度）比室温存活时间长）,对热、干燥、太阳直射敏感,对含氯制剂、碘制剂敏感,对酸和强氧化剂极敏感,煮沸,100,度,12min,即可被杀死,药物敏感性,细菌带有可传递的耐药质粒,近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素,、,强力霉素、复方新诺明 ）,诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性,霍乱的生物学性状,霍乱的致病性,主要毒素,霍乱肠毒素,CT,小带联结毒素,zot,辅助霍乱肠毒素,ace,溶血素、溶细胞素、志贺样毒素,O139,群除具有上述,O1,群的致病物质外，还存在荚膜多糖和特殊,LPS,毒性决定簇，可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜 上。,霍乱的生物学性状,腹泻患者样本采集,水样便采,13ml,，,成形便取指甲大小量,肛拭子：生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内,35cm,处旋转取出,呕吐物采,13ml,标本和碱胨水比例为,1,：,5,水样及液体标本采集,采集相对静止表层水（,30cm,内）,500ml,其他液体标本采集,500ml,23,小时内送检,涂抹样本采集,23,支无菌棉签涂抹,35,只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔,23,支无菌棉签涂抹食品或物品表面（地沟口，下水管口，水池壁涂抹，餐盘内外侧）,直接放入,10ml,碱胨水送检,样本的采集,典型的米泔水样便,动力试验,水样便：取一滴在玻片上，盖盖玻片，暗视野显微镜直接观察,成形便：取适量在生理盐水中研磨，盖盖玻片，镜下观察,高度可疑样本：取增菌的碱胨水在玻片上，盖盖玻片，镜下观察,镜下有穿梭样运动为动力试验阳性,动力抑制试验,取,O1,群、,O139,群霍乱弧菌诊断血清，取适量标本在其中研磨,穿梭样运动消失，菌体凝集成块为动力抑制试验阳性,检验操作程序,增菌及分离培养,碱性蛋白胨水,pH 8.8-9.0,注意标本和胨水的比例要适当,分离培养基分两类,选择性强的培养基,四号琼脂、,TCBS,、庆大培养基,选择性弱的培养基,碱性琼脂和碱性胆盐琼脂,检验操作程序,霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。,(,菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）,型霍乱弧菌在号平板和上的菌落形态,病人粪便标本,增菌,6-8h,庆大平皿划线培养,18-24h,每皿挑取,9-10,个可疑菌落血清凝集试验,向医院属地,CDC,报告医学观察病例,霍乱分群诊断（单克隆抗体）,群,群,二次增菌,6-8h,1,、悬滴动力试验（,+,），动力抑制试验（,+,）,2,、有明确流行病学史，动力试验（,+,），动力 抑制试验（,+,）,症状典型但服药患者便,检验操作程序,菌株的初步鉴定,血清凝集试验,复核及鉴定,血清凝集试验,革兰氏染色,氧化酶试验,粘丝试验,动力试验,检验操作程序,菌株的初步鉴定,血清凝集试验,挑取可疑菌落与,O1,群、,O139,群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性（一般不超过,10s,）,注意：菌液浑浊，似凝非凝不能判定为阳性,同时做生理盐水对照,在,1min,内不出现凝集为阴性,结果可疑时需要做,PCR,鉴定,检验操作程序,菌株的复核及分型,血清凝集试验,用,O1,群、,O139,群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进行玻片凝集,O1,群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集,结果分,3,种情况,同时做生理盐水对照,检验操作程序,菌株的复核及分型,氧化酶试验,弧菌属大部分为阳性，作为弧菌的简易辅助鉴定方法,用氧化酶试剂（,1%,盐酸二甲基对苯二胺）湿润滤纸,取营养琼脂上菌落涂抹于有试剂的滤纸上,反应部位在,12min,内出现粉红,-,紫红,-,紫蓝色判为阳性,肠杆菌科细菌不变色或变粉后很快退色,注意不使用过期试剂和金属接种针,检验操作程序,菌株的复核及分型,粘丝试验,弧菌属大部分为阳性作为弧菌的简易辅助鉴定方法,在玻璃平皿上滴一大滴,0.5%,去氧胆酸钠溶液,取营养琼脂上新鲜培养物研磨后与试剂研磨混合,混悬液变清亮粘稠，可拉出细长丝者为阳性,阴性者呈均匀悬液状态,动力试验,革兰氏染色,检验操作程序,药敏试验,根据美国临床,实验室标准委员会（,NCCLS,）,推荐的,Kirby -Bauer,（,K-B,）,氏法进行。,检验操作程序,菌种接种营养琼脂,3716,18h,菌落接种营养肉汤,374,6h,调整菌液到,0. 5,麦氏单位,MH,培养基上涂布菌液,贴药敏纸片,游标卡尺测量抑菌圈直径,3718,24h,药敏试验注意事项,每次药敏试验,必须用,ATCC 25922,大肠杆菌做质控,使用的,MH,培养基不能太薄,使用的,MH,培养基,PH,值应为7.3,抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限,不可用过期的试剂和药敏纸片,检验操作程序,荧光定量,PCR,方法鉴定,探针和引物,检验操作程序,SO1F,GACTCACCTTCGATTTCAGCAA,SO1R,GAATAACTCAAGGCGATGAAGTGAT,O1 probe,FACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGP,SO139F,GCGGTGTAGCGGGTTTTATTAG,SO139R,TGCATAATACTTTCGACCATGGA,O139 probe,FAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTP,SCTXF,TTTCATCGCAAGTATTACTCATCGA,SCTXR,AAGAGCCGTGGATTCATCATG,CT probe,FAGCATTCCCACAACCCGGCGP,荧光定量,PCR,方法鉴定,模板的制备：,挑取数个菌落加入装有,100,去离子水的,1.5mL,管中,混匀后,100 10,分钟，,12000,转,/,分钟离心,5,分钟，取上清液作为模板。,检验操作程序,荧光定量,PCR,方法鉴定,反应体系的配制,(20 ,体系,),（,Pemix,Ex,Taq,TM,TaKaRa,生物公司提供）,2 PCR,反应混合物：,10,/,份,上游,引物（,10M,）：,0.4,/,份,下游,引物（,10M,）：,0.4,/,份,探针（10,mol,/,）： 0.4,/,份,模板,DNA：,2,/,份,DDw：,6.8,/,份,Total: 20 ,检验操作程序,荧光定量,PCR,方法鉴定,荧光定量,PCR,反应条件,：,95 10s,95 5s,60 20s,结果判定：,Ct,值在,10-30,之间且有典型的“,S”,形曲线,检验操作程序,40,cycles,谢谢,