资源描述
,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,测序原理和流程,引物和,PCR,传统测序法,Sanger,法,新一代测序法,solexa,引物和,PCR,什么是引物,一小段单链,DNA,，用来引发,PCR,反应,什么是,PCR,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应，是复制,DNA,的反应。,做,PCR,的目的是什么,扩增,。由,DNA,链上的已知片段向特定的区域延伸，从而得到,特定区域,的,DNA,。,变性,5,3,5,3,3,5,3,5,引物复性,3,5,3,5,5,3,3,5,P1,P2,延伸,3,5,3,5,5,3,3,5,P1,P2,再变性,首轮扩增结束,再复性,P1,P1,P2,P2,再延伸,P1,P1,P2,P2,第二轮扩增结束,P1,P1,P1,P1,P2,P2,P2,P2,第三轮扩增结束,轮次,长片段数量,目标片段数量,1,2,0,2,4,2,3,6,8,4,8,22,5,10,52,6,12,114,通过不断扩增延伸，长片段线性增长，而目标片段指数增长，最终反应主产物是目标片段,PCR,扩增,NGF,基因（大鼠）,rat beta-nerve growth factor sequence,5,-,301,gttctacact ctgatcacag cgttttt,gat cggcgtacag,gcagaac,cgt acacagagat,361,caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct,421,ctgacacagc cctacgcaga gcccgcagtg cccctgctga accaatagct gcccgtgtga,481,agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacg,ga,gactccgttc,541,accccgcg,tg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc,-,3,Primer 1:(5,)gat cgg cgt aca ggc aga ac(3,)328-347,Primer 2:(3,)cgc ggg gtg aac gga gtc tc(5,)529-548,预期扩增长度：220,bp,DNA Marker,NGF,2000,bp,1000,bp,750,bp,500,bp,250,bp,100,bp,220,bp,通过胶图验证,PCR,是否成功,PCR,的特点和用途,灵敏度高,、,特异性强,1、获取,DNA,2、验证,引物设计的基本原则,有效：能结合到模板上,引物自身没有消耗,唯一：一定范围内不错配,引物的自身消耗,发夹结构：,5-ACATGAGGTACCAGCCCCATGT-3,5-ACATGAGGTAC,|,3-TGTACCCCGAC,引物二聚体结构：,引物,1,：,TACCGAACTCAGGGAACAGC,|,引物,2,：,GACTCCATTGCCTAGCCTGG,引物设计的通常条件,1、引物长度。1530,bp，,通常设计引物都在1827之间的范围内。太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。,2、引物的3,端比5,端重要，5,端如果有个别碱基错配仍可结合，3,端如果有错配则不可结合。3,端尽量不要出现连续相同碱基。,3、,GC,含量。通常在40%60%之间容易进行,PCR,反应，过高或者过低都会增加反应难度。,PCR,的上下游引物,GC,含量不能相差太大。,4、,PCR,的,Tm,值（退火温度）一般在5570 之间。（不同软件的计算差异很大，有时需要摸索条件）,5、引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。,Sanger,测序法,Sanger,测序技术的发展,70,年代末，,Walter Gilbert,发明化学法,Frederick Sanger,发明双脱氧链终止法,手动测序，同位素标记,80,年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧链终止法原理）,荧光代替同位素，计算机图象识别,90,年代中期，测序仪重大改进,集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳,2001,年完成人类基因组框架图,链终止法的原理：,以单条,DNA,链为模板合成互补链。,在合成原料（,2,脱氧核苷酸）中掺入标记过的,2,3,双脱氧核苷酸。,合成互补链的反应会随机终止。,而得到大量终止处带有标记的,DNA,片段。,通过电泳分离这些片段来读出序列。,脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸,链终止法的核心仍然是,PCR,通过反应的随机终止，使读取序列成为可能,峰图文件,PHD,文件,BEGIN_COMMENT,CHROMAT_FILE:rgbsda0_013779.y1.scf,ABI_THUMBPRINT:0,PHRED_VERSION:0.000925.c,CALL_METHOD:phred,QUALITY_LEVELS:99,TIME:Mon Aug 9 15:08:48 2004,TRACE_ARRAY_MIN_INDEX:0,TRACE_ARRAY_MAX_INDEX:5301,TRIM:0 648-1.00,CHEM:unknown,DYE:unknown,END_COMMENT,BEGIN_DNA,a 27 45,c 27 53,a 34 60,t 34 66,a 33 74,END_DNA,END_SEQUENCE,Sequence file(Fasta),rax_539101.y1.abd CHROMAT_FILE:rax_539101.y1.abd PHD_FILE:,rax_539101.y1.abd.phd.1 CHEM:term DYE:ET TIME:Mon Oct 30,15:10:42 2000,CCCCCCCCTCAAGTAAAATACTATCTCGGAACGACATAACGTTTTAGATT,CGTCATAGTCTTTCCTGTACAACTCATTGAGCCTCACGCCGTTGTCCATT,TGCTGTTTGCCATTTAGTCGTACGTCGGTGGGACAGGGGAGTCGGATGTA,TAGCAGGTTCTTTACAATATTGCAGCACCATGGGTTCGCCAGAGAGTTGT,GGGTCTTCTATTGATCATAGATATCTAGCGATGCCTAAGTGCATGGTTTA,TCTTCTGAGAATATATTCTTTCATAGTGAGGGGTCATTCACCGTAATTAG,TTCTGGACTCTTTTGGAGAATTATTAAATTATTTGATGACCTTGAAATAT,TTTGCCATTATTCAATGTGCTCATAATAATATTAAGATTTATGTCTACCA,TGCTTGAATAATTGATATTAACATCATAAGATTTTAAATAAGATTTATAT,TTTTAGATACACCTTAGAAACACTTCCATAATATATCATTTCGCTAACTT,Quality file(Fasta),203c04_0102.g1.abi 682 17 430 ABI,21 21 29 26 26 26 32 33 47 48 48 51 51 51 46 42 42,32 33 47 48 48 51 51 51 46 42 35 34 34 34 34 34 42,42 42 56 56 56 56 48 48 44 44 42 42 42 42 42 42 35,31 31 31 31 35 42 48 56 51 51 42 42 42 42 40 45 37,37 40 36 45 35 35 35 32 45 45 42 42 37 37 37 37 44,44 56 56 42 42 36 35 35 35 35 35 37 37 37 40 51 51,51 51 56 56 56 56 56 56 42 44 46 43 42 40 40 45 45,35 35 35 29 29 17 29 31 40 39 45 40 42 40 42 37 35,35 35 35 37 42 42 44 46 43 43 43 42 42 42 42 42 42,42 37 42 44 44 56 37 37 37 37 37 37 46 51 44 43 42,42 35 36 30 33 33 38 38 36 36 36 36 42 42 44 37 37,37 37 37 31 29 29 29 24 24 28 28 28 36 42 44 42 42,42 35 29 29 29 29 29 29 42 29 35 29 25 25 32 27 25,16 17 17 24 24 29 29 23 29 33 40 40 40 40 25 25,目前华大的,Sanger,测序仪有以下两种：,Megabace,96,孔板，读长,500bps,，,scf,格式峰图,3730/3700,384,孔板，读长,700bps,以上，,ab1,格式,质量的控制,用质量值,Q,来判断结果的可靠性,Q=-10*logX (X,是单碱基错误率,),Trim,掉低质量序列，使用高质量序列,一些问题,为什么,GC,过高或过低的,DNA,会造成测序困难？,高质量的测序结果一定可信吗？,引物在测序模板上的结合位置不唯一会导致什么后果？,测序模板本身不唯一会导致什么后果？,新兴的测序方法,solexa,Solexa,测序方法是由,solexa,公司（目前已被,illumina,兼并）开发的低成本高通量的测序方法。于,2006,年发布。,目前,solexa,测序的主要用途是重测序和表达分析，全基因组测序组装尚处在试验过程。,反应单位：,cluster,A C,T G,Cycle N,Solexa,的优缺点,优点,通量大，成本低（,sanger,法的,1/100,）,shotgun,测序的覆盖度和随机性相对较好,缺点,目前技术尚不成熟,读长太短，拼接难度大,Solexa,数据,读长：,3575bps,时间：,3days/SE36run,通量：,1G/run,质量：理想情况下接近,Q40,标准,GC,敏感度：相对低,为什么说,solexa,是,“,下一代,”,测序技术,反应模板的承载方式的改变,从孔到簇,从游离态到固态,反应控制方式的改变,从个体控制转为进程控制,最终结果是通量的飞跃,从点到面,测序的发展方向,质量,读长,通量,成本,
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