致病菌细胞的近红外光谱鉴别方法研究

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,致病菌细胞的近红外光谱鉴别方法研究,立题意义,致病菌可导致人类疾病或危害人类健康，污染食品可引起食物中毒与食源性感染，是食品安全的重大隐患。快速检测出食品中的致病菌是人们迫切的心愿。,本文以沙门氏菌和单增李斯特菌为代表，利用对数期的沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱和主成分投影判别分析技术,（PCA），,鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌。,此项研究有可能对致病菌和有害微生物的鉴别测定提供一种快速简便的检测方法。,试验方法,采用平板划线分离培养法和选择性培养基 分离纯种的沙门氏菌、单增李斯特菌。,采用光电比浊法，对沙门氏菌的对数生长期进行研究，确定沙门氏菌的对数生长期。,根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱图谱，利用主成分投影判别分析技术，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。,结果分析,1、沙门氏菌的分离培养结果,取出亚硫酸铋琼脂（BS）平板看到呈褐色，灰色或黑色，带有金属光泽的菌落。并且菌落周围的培养基开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为了黑色，即是典型的沙门氏菌菌落。接种到营养琼脂试管斜面上放在冰箱中保存，以备下一步试验用。,2、单增李斯特菌的分离培养结果,取出改良的MC Bride琼脂（MMA）平板，斜光照射，可以看出菌落为灰蓝或蓝色、小的圆形菌落。挑取几个发育良好的孤立菌落接种于三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于25的恒温培养箱中，观察到有动力，且呈伞状或月牙状生长的菌落。这是单增李斯特菌的典型菌落。接种到（TSAYE）试管斜面上放在冰箱中保存，以备下一步试验用。,3、沙门氏菌的生长曲线,、比浊法测定的吸光度值,以未接种的营养肉汤培养基作空白对照，选用600nm波长进行测定，按编号从小到大的顺序依次进行。沙门氏菌比浊测定的吸光度（OD）值见下表,培养时间（,h,）,吸光度（,OD,）值,空白对照,0.041,1,0.041,2,0.042,3,0.042,4,0.043,5,0.044,6,0.049,7,0.054,8,0.058,9,0.062,10,0.066,11,0.069,12,0.071,13,0.074,14,0.075,15,0.077,16,0.082,17,0.083,18,0.084,19,0.083,20,0.084,21,0.084,22,0.084,23,0.083,24,0.082,、生长曲线图,、从生长曲线图，可以看出0-5h为沙门氏菌的延缓期，5-16h为对数生长期，16h以后逐渐进入稳定期和衰亡期。符合典型细菌生长曲线四个时期的划分。本实验选16h为沙门氏菌的培养时间，进行下一步的试验。,4、沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别,沙门氏菌不同浓度全细胞、细胞壁、细胞质的光谱叠加图,单增李斯特菌不同浓度全细胞、细胞壁、细胞质的光谱叠加图,沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的鉴别分析,从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.050.03之间，第二组分得分范围在-0.13-0.02之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在-0.090.04之间，第二组分得分范围在0.010.25之间。可见两种菌的第一主分得分范围几乎完全相同，而第二主分得分范围明显不同。,不同的细菌，其细胞的物质组成是不一样的。不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。,沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的鉴别分析,从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.100.05之间，第二组分得分范围在-0.020.15之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.050.28之间，第二组分得分范围在-0.30-0.02之间。可见两种菌的第一主分和第二主分得分范围完全不同。,沙门氏菌为革兰氏阴性菌，单增李斯特氏菌为革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌的细胞壁除了肽聚糖还含有外膜，包括脂多糖、脂质双层、脂蛋白三部分；革兰氏阳性菌除了肽聚糖还含有大量磷壁酸。其细胞壁组分不相同，不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。,沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的鉴别分析,从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在0.040.12之间，第二组分得分范围在-0.22-0.10之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.020.06之间，第二组分得分范围在-0.030.12之间。两种菌的第一主分得分范围有相似的地方，第二主分得分范围明显不同。,细菌的细胞质是指被细胞膜包围的除核区以外的一切半透明、胶体状、颗粒状物质的总称，主要成分为核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、质粒、各种营养物质和大分子的单体等。两种不同的细菌其细胞质组成也不同，所以可以通过近红外光谱法区分开来。,总结,1、采用平板划线分离培养法和选择性培养基可将沙门氏菌、单增李斯特菌从杂菌中很好的分离开来。,2、采用比浊法对沙门氏菌的生长曲线进行研究，并绘制生长曲线图。研究表明：5-16h为沙门氏菌对数生长期。所以可选取培养16h的沙门氏菌进行后续试验。,3、根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱，利用基于主成分分析技术的投影判别分析，可以将沙门氏菌和单增李斯特菌区分开来。,4、近红外光谱分析技术可以用于沙门氏菌、单增李斯特菌的分类鉴别。为建立一种快速的致病菌检测方法提供依据。,5、但是，到底是什么物质引起近红外光产生特异性吸收还不知道，尚需进一步研究，利用近红外光谱分析技术对更多种类致病菌的检测技术也需要进一步研究。,讲解完毕！,O(_)O 谢谢！,