实验四__细菌质粒的接合转移

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 细菌质粒的接合转移,李晓华 程国军,一：目的要求,了解在自然条件下微生物遗传信息传递的方式；,掌握细菌质粒转移的原理和流程。,二：基本原理,在质粒转移过程中，供体菌与受体菌细胞通过结合作用紧密接触，质粒从供体细胞向受体转移，同时进行质粒复制，这就是结合转移的过程。按能否自主转移，将天然存在的质粒分为两大类。,1,转移型质粒,：多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（,tra,）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如：,大肠杆菌：,F,因子、,R1,、,R100,、,R6K,、,RP4,天蓝色链霉菌：致育性因子,pSCP1,、,pSCP2,2,非转移型质粒,：多为高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的,ColE1,、,RSF1010,等。由于缺少转移基因（,tra,），不能自主转移，但由于含有与,F,质粒类似的,bom,（或,nic,）位点或诱动基因,mob,（,mobilization,），因而能被带有,tra,基因的转移性质粒诱动而发生转移,。,转移子的筛选,筛选培养基为：,基本培养基,+,抗生素,；,供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能在基本培养基上生长；,未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平板上生长。,三：实验菌株,供体菌：,E.coli,DH5(pTR102) (,Tc,R,),，含有,mob,基因,；,受体菌,:,紫云英根瘤菌,(,Tc,S,),；,辅助菌,:,E. coli,MM294 (pPK2073),（,Spe,R,），含有,tra,基因。,四：实验内容,准备,将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：,供体菌：,E.coli,DH5(pTR102) (,TcR,),，,LB +,Tc,20g /ml,，,37,震荡培养,1,夜；,受体菌,:,Sinorhizobium,fredii,(,TcS,),，,TY, 28,震荡培养,2,天；,辅助菌,:,E. coli,MM294 (pPK2073),（,SpeR,），,LB +,Spe,50,g,/ml 37,震荡培养,1,夜,用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各,0.4ml,，吸受体菌,0.6ml,，都加入同一,eppdorf,管内（每个同学做,1,管），放入离心机内，,10000,转,/min,离心,1,分钟。,倒上清，向沉淀加,1ml,的,TY,液体，用,tip,上下抽吸，洗涤菌体，再,10000,转,/min,离心,1,分钟，倒上清，留,100l,左右用于悬浮菌体。,倒,TY,平板，然后用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的,TY,平板上（,每,2,个同学,1,片，,2-3,片,/,平板,）。用,200l,的,tip,抽吸,eppdorf,管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）,吹干。,28,培养,2,天。,操作步骤（第一天）,倒,SM,平板,将基本培养基（,SM,）溶化，加千分之一的维生素混合液，然后加相应量的四环素（,15U/ml,），每,2,人,1,皿。,另准备,1,瓶基本培养基，不加抗生素，用于对照。,将倒好的平板用报纸包好后放入,4,冰箱，备用。（,注：四环素在强光下易分解,）,向灭菌青霉素瓶中加,3ml,无菌水，将已培养的,TY,平板上的滤纸片用无菌镊子放入水中，在震荡混匀器上洗菌体，充分打散,。,向,1ml,的,ep,管加,0.9mL,无菌水，取,0.1ml,菌液，混匀。,吸取,200L,涂皿。,少数同学另取稀释液，涂,1,板不加,Tc,的,SM,做对照 。,平板放,28,培养,4-6,天后看结果。,操作步骤（第三天）,五：实验报告内容,转移频率,=,SM+Tc,平板的单菌落数,/,纯,SM,平板的单菌落数,SM+Tc,平板的单菌落数为：,纯,SM,平板的单菌落数为：,六：思考题,你认为本次实验方法适合哪些方面的研究工作？,