原位杂交技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,原位杂交技术,In situ hybridization,制作人：生工,141-,董弦弦,生工,141-,余军,原位杂交技术的概念,原位杂交技术的发展简史,原位杂交技术的原理、条件及方法,原位杂交技术的应用,概念,原位杂交技术是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射体系，在组织、细胞、间期核计染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。,可分为两类：,RNA,原位杂交和染色体原位杂交两大类。,RNA,原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的,mRNA,分子，两者杂交产生双链,DNA,，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫变色，对该基因的表达产物在细胞水平上做定性定量分析。,主要用来检测细胞和组织内,RNA,表达的一种原位杂交技术。,荧光原位杂交：首先对寡核苷酸做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或,DNA,上特定的序列结合，通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该,DNA,序列在染色体的位置。,常用于已知基因或序列的染色体定位和未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。,Back,发展简史,1969,年美国耶鲁大学,Gall,和,Pardue,首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确认该基因位于卵母细胞的核仁中。,1970,年，,Orth,应用,3H,标记的兔乳头状瘤病毒,cRNA,探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒,DNA,在细胞中的定位。,发展简史,1971,年，,Jacob,创立电镜原位杂交技术检测爪蟾卵母细胞,DNA,80,年代，原位杂交技术飞速发展，现已能检测只有数百碱基对的较小分子,DNA,和含量很低的,mRNA,当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。,发展简史,1981,，,Bauman,等首先应用荧光素标记,cRNA,探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功,荧光杂交技术。,1982,，,Shroyer,报道用,2,，,4,二硝基苯甲醛（,DNP,）标记,DNA,探针，使该,DNA,探针具有抗原性，然后用兔抗,DNP,的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针,上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。,发展简史,1987,年,Pezzella,用磺基化,DNA,探针，以单克隆抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。,优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，敏感度较高。,发展简史,1991,年,Couton,建立将非放射性标记技术更新为亲和复合物标记技术,发展趋势：实验室常规技术和临床日常应用的诊断技术。,Back,原位杂交技术的原理,使含有特殊序列、经过标记的核苷酸单链探针，既带有标记的（,放射性同位素,，如,3H,、,35S,、,32P,，荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）,DNA,或,RNA,片段，与组织切片或细胞内待测核酸（,RNA,或,DNA,）片段既靶细胞进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的,mRNA,或,DNA,的存在并定位。,原理：碱基互补配对原则,原位分子杂交,杂交体,杂交条件,严格度概念,杂交体,DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA,稳定性：,DNA-DNADNA-RNA RNA-RNA,稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度,盐浓度等,温度等,原位杂交技术的条件,杂交液,探针浓度,温度,PH,时间,杂交液,钠盐（杂交效率提高 非特异性反应）,甲酰胺（使杂交所需温度降低）,硫酸葡聚糖（提高探针浓度）,牛血清白蛋白和载体,DNA,等,（阻断探针与组织非特异性结合）,探针浓度,探针浓度影响杂交反应浓度,放射性标记探针,0.5ug/ml,非放射性为,2ug/ml,最适宜的探针浓度要经过具体实验摸索得到确定。,温度,杂交时温度一般低于相对杂交体,Tm,值,25,（,T,m,值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度。）,当杂交液含,50,甲酰胺、盐浓度,0.75mol/ml,左右时杂交温度：,对,DNA,探针是,42,对,RNA,探针是,50-55,对寡核苷酸探针是,37,PH,ph,在,5-9,范围内，杂交体形成不受影响。,常用缓冲液浓度,ph,为,6.5-7.5,时间,一般探针浓度下，杂交反应在,4-6,小时内完成。,孵育,6,小时后,-,杂交信号不在增强。,反应超过,24,小时后,-,已形成的杂交体可能发生解链，杂交信号反而减弱。,严格度概念,在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核酸序列相结合而形成不稳定的杂交体。,严格度,决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件称为,严格度,。,高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成杂交体,低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也可以形成杂交体,原位杂交的方法,1.,探针,2.,组织样品制备,3.,原位杂交,4.,基本实验过程,探针,（,一）探针的选择,cDNA,和,RNA:,适宜于,检测,mRNA,分子,（二）探针标记物的选择,原位杂交标记物的检测灵敏度排序,32,P,35,S,3,H,地高辛,/,生物素,生物素：,在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。,地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。,（动物细胞中不存在）,组织样品制备,（一）,.,去除或抑制,RNA,酶,方法有两类,：,物理方法：,对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高温烘烤（,180-200,干烤,4-6,小时）。,对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒,化学方法：,焦磷酸二乙酯（,DEPC,）,作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性,（二）取材,组织要求新鲜，迅速投入到固定液中,标本置于低温环境下可抑制,RNA,酶作用,（三）固定,4,多聚甲醛培养,2-6,小时（培养细胞,30,分钟）,（四）包埋和切片,常规方法,（五）,电镜杂交技术,（六）冷冻切片,冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交信号,原位杂交,（一）杂交前处理,1.,灭活内源性酶,在用酶作为报告分子时,（过氧化物酶 碱性磷酸酶）,2.RNA,酶处理,3.,盐酸和乙酸酐处理,提高杂交效率并降低背景,4.,通透处理,消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞,周围的蛋白质，增加探针等反应分子对,靶核酸分子的接触机会,（,二）预杂交（三）探针和靶细胞的变性,（二）预杂交,将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育作用是减低非特异反应，改善杂交信号。,（三）探针和靶细胞的变性,当靶细胞或探针位,DNA,时，杂交前需要使它们变性成为单链。,（四）杂交,组织切片的杂交方法,：,滴加含有探针的杂交液之后，盖上高温烘烤过并硅化过的盖玻片或无菌的石蜡膜置于一湿盒内，在合适温度的烤箱内杂交,超薄切片：,将镍网的切片面朝下浮于杂交液液滴上，置于湿盒内杂交,（五）杂交后漂洗,用浓度递减的,SSC,溶液，在一定温度和震荡下漂洗切片,。（这一步骤可以调节严格度）,如果杂交信号太弱或没有，可以降低漂洗的严格度,如果背景太强、信号不特异，可提高漂洗严格度,原位杂交实验基本过程,探针标记纯化变性,原位杂交杂交体探测：,样品制备切片通透处理,放射自显影,免疫细胞化学,原位杂交技术的应用,细胞特异性,mRNA,转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；,感染组织中病毒,DNA/RNA,的检测和定位，如,EB,病毒,mRNA,、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒,DNA,的检测；,癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；,基因在染色体上的定位；,检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；,分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。,Thanks,电镜,电子显微镜简称“电镜”。,电子显微镜,以电子束作为光源，利用电磁透镜成像结合特定的机械装置和高真空技术而构成的一种精密的综合性电子光学仪器。,其最大优点是分辨率极高，放大倍数最高可达几十万倍,电镜,电子显微镜由镜筒，真空装置，电源柜三部分组成。,镜筒主要有电子源，电子透镜，样品架，荧光屏和探测器等部件，自上而下组装成柱体。,