制片、染色及显微观察

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,食品微生物检验规范操作基础培训,5 制片、染色及显微观察,福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.05,主要内容：,1,清洗、消毒和灭菌操作,2,培养基的制备,3,采样和取、制样,4,接种、分离纯化,5,制片、染色及显微观察,6,实验室安全基础知识,5.1,显微操作,显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。,显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。,食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。,显微镜的使用方法,用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先,低倍镜观察，,后,高倍镜观察，再油镜观察,。,低倍镜操作方法,1.两眼从侧面注视 低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距23mm时停止；,2.左眼注视 （注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止；,3. 再用微调焦螺旋调至清晰。,注意：,粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰,高倍镜操作方法,1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央；,2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面；,3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。,注意：,高倍镜观察时，光线需增强。,油镜操作方法,1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央；,2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油；,3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止）；,4.用微调焦螺旋调至清晰。,注意：,油镜的操作需要较强的关线，故需将光线调至最强。,用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍或100倍）选择合适的视野（,油镜镜筒上通常刻有或OEL等标志,）,油镜用后的处理：,第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油；,第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹；,第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。,普通显微镜的保养,(1)观察完后，移去观察的载玻片标本。,(2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。,(3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。,(4),将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。,镜头清洁，只能用,软而没有短绒毛,的,擦镜纸,，,物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中,最安全的是二甲苯,。,5.2 制片和染色,染色原理,由于微生物细胞含有大量水分，,机体是无色透明的,，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的,菌体与背景形成明显的色差,，从而能更清楚地观察到其,形态和结构,。,微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。,细菌带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。,微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。,细菌的形态,杆菌,螺形菌,球菌,细菌的测量单位：,微米(m),细菌的大小与形态,染色方法,(一)简单染色法,简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。,(二)复染色法,用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有,革兰氏染色法和抗酸性染色法。,革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：,染色反应呈蓝紫色的称为,革兰氏阳性细菌,，用,G,+,表示；,染色反应呈红色的称为,革兰氏阴性细菌,，用,G,表示。,细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们,细胞壁的成分和结构,不同而造成的。,实验材料,1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯、蜡笔等。,2.草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃红染液、石炭酸复红染液,3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌,实验内容与步骤,(一)细菌的简单染色步骤,涂片,干燥,固定,染色,水洗,干燥,镜检,1,涂片,取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，,涂布面不宜过大,。,2,干燥,涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但,切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形,。,3,固定,手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过,23,次，共约,23,秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，,不觉过烫为宜（不超过,60,）,放置待冷后,，,进行染色。,4,染色,在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。,5,水洗,斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至,洗下的水呈无色为止,。,6,干燥,用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。,用吸水纸时,切勿将菌体擦掉,。,7,镜检,(二)细菌的革兰氏染色步骤,涂片,干燥,固定,初染,水洗,媒染,水洗,脱色,水洗,复染,水洗,干燥,观察,1取培养物分别做,涂片、干燥、固定,，方法均与简单染色的相同。,2用,草酸铵结晶紫,染色1min后水洗。,3加,碘液,媒染1min后水洗。,4斜置载玻片，滴加,95乙醇,脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时,2030s，随即水洗,。,5用,蕃红,染液复染1min，水洗。,6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。,革兰氏染色图解,革兰氏染色试剂,步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上,步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上,步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层,步骤4：风干,步骤5：,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定,步骤6：结晶紫染色1分钟,步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片,步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗,步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗,步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗,大肠杆菌（,Escherichia coli,）革兰氏染色图,革兰氏染色阴性杆菌（红色）,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus,）革兰氏染色,革兰氏染色阳性球菌（紫色）,注意事项,1,革兰氏染色成败的,关键是脱色时间,，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认,为革兰,氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须,严格,把握脱色时间。,2 ,选用培养,18,-,24,小时菌龄,的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰,氏阳性菌,转呈阴性反应。,3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。,鞭毛,化学组成：,鞭毛蛋白,功能：,运动器官,与致病有关,鉴定分类细菌,荚膜,化学组成：,多糖或多肽,功能：,抗吞噬作用,粘附作用,抗有害物质损伤作用,芽孢,脱水而成，为细菌休眠形式,功能与医学上意义：,对外界的抵抗力增加,可发芽成繁殖体有致病性,有鉴别作用,应以杀死芽胞为灭菌效果的指标,菌毛,化学组成：,菌毛蛋白,种类与功能：,普通菌毛与致病有关,性菌毛与遗传变异有关,Thank,you,for,your,attenti,on.,