第04章 定量分析样品前处理

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法,一、概述,目的：为满足所选用的分析方法对试样的要求,使之处于可测定状态。,1,、多数具有特殊结构或取代基的化学原料药可,不经特殊处理，用适当的溶剂溶解,直接采用,滴定法、分光光度法或色谱法测定；,2,、药物制剂,排除处方组成中的干扰组分；,3,、含金属或含卤素、硫、磷、硒等特殊元素的,药物,依据其在药物分子中结合状态，进行,前处理方法的选择。,含卤素（金属）有机药物,药物分子结构中所含卤素（金属）直接与芳环,或脂肪链相连者。,*,而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。,结构特点：,CX,（,一）含金属的有机药物的结合形式,1,、金属离子不直接与,C,原子相连：,通常为有机酸或酚类的金属盐或配位化合,物，常称为,含金属的有机药物；,*,若有机结构部分不干扰测定，可,不经有机破坏,直接在溶液中进行定性定量分析。,2,、金属离子直接与,C,原子以共价键相连：,称为,有机金属药物，需,经有机破坏,使其转变,成为无机盐类后进行分析。,（二）卤原子的结合形式（活泼性）,卤原子与碳原子直接相连,卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系：,（,1,）乙烯型卤和芳卤： 不活泼,碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流,（,2,）烯丙型卤和苄卤： 活泼,（,3,）卤代烷型： 介于两者之间,碱性溶液直接回流,2.,分子中所含卤原子的个数,分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显。,二、不经有机破坏的分析方法,（一）直接测定法,凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些,C,M,（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方法进行测定。,1.,配位滴定法：,利用二价金属离子可与乙二胺四乙酸二钠形成配位化合物，可用乙二胺四乙酸二钠直接滴定。如,葡萄糖酸钙的含量测定。,2.,氧化还原滴定法：,利用不同价态的金属离子的氧化还原性，选用适当滴定液直接或间接滴定法测定含量。,如,富马酸亚铁的含量测定,Ch.P,(2005),取本品约,0.3g,，精密称定，,加稀硫酸,15ml,，加热溶解后，,放冷，加新沸过的冷水,50ml,与邻二氮菲指示液,2,滴，立即用硫酸铈滴定液,(0.1mol/L),滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每,1ml,硫酸铈滴定液,(0.1mol/L),相当于,16.99mg,。,原理,Fe,2+,+ Ce,4+,Ce,3+,+ Fe,2+,Fe,2+,-,e,Fe,3+,红色,浅蓝色,O,O,C,C,H,O,H,C,C,O,+,Fe,2+,（二） 经水解后测定法,1.,碱水解后测定法,本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加入氢氧化钠溶液（或一定量过量的硝酸银滴定液）后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（,Volhard,法）测定。,本法适用于含卤素有机药物结构中卤素,原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者）。,原理,三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使,Cl,-,生成,AgCl,沉淀，过量的硝酸银，以,Fe,3+,为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。,例,:,三氯叔丁醇的测定,Ch.P,（,2005,）,CCl,3,-,C(CH,3,),2,-,OH + 4NaOH,回流,(CH,3,),2,-,CO +,3NaCl,+,HCOONa,+ 2H,2,O,NaCl,+ AgNO,3,AgCl,+ NaNO,3,AgNO,3,+,NH,4,SCN,AgSCN, +,NH,4,NO,3,（淡棕红色）,(,K,sp,=1.5610,10,),(,K,sp,=1.010,-,12,),Fe,3+,+ SCN Fe (SCN),2+,2,、酸水解后测定法,如,硬脂酸镁的测定,Ch.P,（,2005,）,取本品约,0.1g,，,精密称定，精密加硫酸滴定液,(0.05mol/L) 50ml,，,煮沸至油滴澄清，继续加热,10min,，,放冷至室温，加甲基橙指示液,12,滴，用氢氧化钠滴定液,( 0.1 mol/L ),滴定。每,1 ml,硫酸滴定液,( 0.05mol/L ),相当于,2.016mg,的,Mg,O,。,原理：,Mg(C,17,H,35,COO),2,+ H,2,SO,4,MgSO,4,+,2 C,17,H,35,COOH,2NaOH + H,2,SO,4,Na,2,SO,4,+ 2H,2,O,(,三,),经氧化还原后测定法,1.,碱性还原后测定,卤素结合于芳环上时,由于分子中碘的结合较牢固,需在碱性条件下加还原剂（如锌粉）加热回流，使结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（,Fajans,法）测定。,本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物,。,例 泛影酸的测定,Ch.P,(2005),取本品约,0.4g,，,精密称定，,加氢氧化钠溶液,30ml,与锌粉,1.0g,，,加热回流,30min,，,放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤,3,次，每次,15ml,，,洗液与滤液合并，加冰醋酸,5ml,与曙红钠指示液,5,滴,，,用硝酸银滴定液,(0.1mol/L),滴定。每,1ml,硝酸银滴定液,(0.1mol/L),相当于,20.46mg,的,C,11,H,9,I,3,N,2,O,4,。,C,O,O,H,I,N,H,C,O,C,H,3,I,I,H,3,C,O,C,H,N,+ 11NaOH + Zn,回流,C,O,O,Na,N,H,2,H,2,N,+ 3NaI + 2CH,3,COONa,+ 2Na,2,ZnO,2,+ H,2,O,USP (24)、BP（1998）,Ch.P(2005),收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。,2.,酸性还原后测定法,取本品的干燥品约,0.4g,，,精密称定，,加锌粉,1g,及冰醋酸,10ml,，,加热回流,30min,，,放冷，冷凝管用水,30ml,洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水洗涤,2,次，每次,20ml,，,洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液,1ml,，,用硝酸银滴定液,(0.1mol/L),滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每,1ml,硝酸银滴定液,(0.1mol/L),相当于,19.031mg,的,C,11,H,12,I,3,NO,2,。,例 碘番酸的测定,JP (13),3.,利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,(1),含锑药物,(2),含铁药物,三、经有机破坏的分析方法,适用于,金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物,即采用上述方法难以将有机结合的待测原子转变为可测定的无机离子（或氧化物、无氧酸等）的,有机金属药物,。,包括：湿法破坏和干法破坏两种。,(,一,),湿法破坏,即,酸破坏法。,依据所用试剂的不同,（,1,）硝酸高氯酸法：,经破坏后得到的无机金属离子一般成高价态。,*,此法破坏能力强，反应较剧烈，所以破坏时 不能将溶液蒸干，以免发生爆炸。,*本法不适合含氮杂环类有机物，破坏不完全。,*适合：生物样品和含动植物药制剂的破坏。,（,2,）硝酸硫酸法：,适合大多有机物质的破坏，无机离子均氧化成,高,价态。,不适合能与硫酸形成不溶性盐的金属离子。,（,3,）硫酸硫酸盐法：,常用的硫酸盐：硫酸钾或无水硫酸钠。,加硫酸盐的目的：提高硫酸的沸点，,增强硫酸的氧化,破坏能力,以使样品破坏完全；,防止硫酸在加热过程中过早分解成,SO,2,而损失。,*,金属离子以,低,价态存在；,常用于：含砷或锑的有机药物的破坏,As,3+,Sb,3+,；,凯氏定氮法,氮测定法。,（,4,）,其它湿法：,硝酸,硫酸,高氯酸法；,硫酸,氧化剂法（过氧化氢法、高锰,酸钾）破坏后，金属呈,高,价态。,HNO,3,-H,2,SO,4,-HClO,4,法、,H,2,SO,4,-H,2,O,2,法、,H,2,SO,4,-KMnO,4,法。,(,二,),干法破坏,适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。,不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏。,也称碱破坏法,有机物,Ca(OH),2,或,Na,2,CO,3,或,MgNO,3,(MgO),小火灼烧，炭化，高温炽灼，完全灰化以达分解。,*,加碱,Ca(OH),2,或,Na,2,CO,3,或,MgNO,3,(MgO,),的目,的帮助灰化完全。,*,中国药典有机药物中砷盐检查碱破坏法。,1,）加热灼烧时温度在,420,以下，以免某些被测金属化合物挥发；,2,）灰化是否完全影响测定结果的准确度；,如需检查灰化放冷稍过量的稀盐酸水,（,1,：,3,）或硝酸水（,1,：,3,），振,摇，若呈色或有不溶有机物，可,在水浴上将溶液蒸干，小火炭化,后，再行灼烧。,3,）本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但,此时切勿弃去。,a.,石灰法：,氢氧化钙小火灼烧炭化后，,500,600,炽灼完全灰化，待砷转化为非挥发性的亚砷酸钙,Ca,3,(AsO,3,),2,，再依法检查。,*,本法操作简单，但应注意完全灰化，否则可使,砷斑较浅且重现性差。,b.,无水碳酸钠碱融法,:,环状结构的有机酸碱金属盐苯甲酸钠、对氨基水杨酸钠，采用石灰法不能破坏完全，可采用此法。,c.,硝酸镁乙醇溶液法：,炽灼破坏分解有机物，使砷转化为非挥发性的砷酸镁,Mg(AsO,4,),2,，残渣质轻，,HCl,易溶。,*,本法操作简单，易于灰化，并且砷能定量回收。但应注意灰化完全，使硝酸镁完全分解为氧化镁。,*,如有硝酸盐或亚硝酸盐残留，则在酸性溶液中生成硝酸和亚硝酸，影响砷化氢气体的生成。,(,三,),氧瓶燃烧法,（,1,）原理,氧瓶燃烧法：,将有机药物放入,充满氧气,的,密闭,燃烧瓶中进行,燃烧,，并将燃烧所产生的欲测物质,吸收,于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析,本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,（,2,） 仪器与材料,仪器装置,燃烧瓶为,500,、,1000,或,2000ml,无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞,空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样,A.,固体样品 无灰滤纸,B.,液体样品 纸袋,C.,软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,吸收液,A.,作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。,氧气,B.,吸收液的选择,氟,水,（,HF,）,氯,NaOH,溶液,(,HCl,),溴,H,2,O,2,-NaOH(HBr),NaOH,-,硫酸肼饱和溶液,碘,NaOH,硫酸肼饱和溶液,(,少量,I,2,、,HIO,3,、,HIO,；微量,HI),硫,NaOH,或,H,2,O,2,（,SO,3,）,硒,硝酸溶液（,SeO,2,少量,SeO,3,）,（,3,）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备,用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气,1min,，,立即用表面皿覆盖瓶口。,样品的准备,取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧,点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置,15min,，,用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,（,4,）,注意事项,Ch.P,（,2005,）规定的燃烧瓶体积为,500,、,1000,或,2000ml,三种，采用常量或半微量分析。,待分解样品量,燃烧瓶的体积,35mg,（,微量分析）,150250ml,2030mg,（,半微量分析）,300500ml,5060mg,1000ml,0.60.7g,或更多,2000ml,或特殊结构的燃烧瓶,正确选用燃烧瓶的目的在于： 样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,测定含氟有机药物时，用石英制,燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,例 碘苯酯的含量测定,ChP,（,2000,）,原理,碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴,-,醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出,游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,（,5,）应用,取本品约,20mg,，,精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液,2ml,与水,l0ml,为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液,(,取醋酸钾,10g,，,加冰醋酸适量使溶解，加溴,0.4ml,，,再加冰醋酸使成,1000m1)l0ml,，,密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约,lml,，,用水洗涤瓶口，并通入空气流约,3,5min,以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾,2g,，,密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液,(0.02,Mol/L),滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。,每,lml,的硫代硫酸钠滴定液,(0.02mol/L),相当于,1.388mg,的,C,19,H,29,IO,2,。,滴定度的计算 放大反应,2mol,碘苯酯,1molI,2,1molI,2,1molNaIO+1molNaI,1molNaIO1/3molNaIO,3,+2/3molNaI,molNaI+Br,2,molNaIO,3,即,2mol,碘苯酯,2molNaIO,3,2mol NaIO,3,+10I,-,6molI,2,即,2mol,碘苯酯,1molI,2,6molI,2,12molI12molNa,2,S,2,O,3,反应摩尔比为,16,98,：,140.,氧瓶燃烧法中的装置有,A.,磨口硬质玻璃锥形瓶,B.,磨口软质玻璃锥形瓶,C.,铂丝,D.,铁丝,E.,铝丝,96,：,133,（,99x,：,138,）,选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品,A.,磨口硬质玻璃锥形瓶,B.,铂丝,C.,普通滤纸,D.,氢气,E.,无灰滤纸,99,：,76,氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为,A. H,2,O,2,溶液,B. H,2,O,2,NaOH,溶液,C.,NaOH,溶液,D,硫酸肼饱和液,E.,NaOH,硫酸肼饱和液,99,：,134.,氧瓶燃烧法可用于,A.,含卤素有机药物的含量测定,B.,醚类药物的含量测定,C.,检查甾体激素类药物中的氟,D.,检查甾体激素类药物中的硒,E.,芳酸类药物的含量测定,第二节,常用定量分析方法,一、化学分析法,包括重量分析和滴定分析,所用仪器简单，结果准确，主要用于制剂中含量较高的一些成分或矿物药 制剂中的无机分析,灵敏度低，操作繁琐，耗时长，专属性不高，对微量成分测定的准确性不理想,（一）重量分析法,分为挥发法，萃取法和沉淀法。,挥发法：测定具有挥发性或定量转化为挥发性物质的组分含量,萃取法：根据被测组份在互不相溶的两相中溶解度不同，达到分离的目的,沉淀法：将被测组份定量专为难溶性化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。,（二）滴定分析法,分为酸碱滴定，沉淀滴定，配位滴定，氧化还原滴定等,酸碱滴定法适用于中药制剂中所含的生物碱，有机酸组分的含量,沉淀法分为银量法，四苯硼钠法和亚铁氰化钾法等，中药用于测定生物碱，生物碱的氢卤酸盐以及含卤素的其他有机成分的含量。,常用的配位滴定法包括,EDTA,法和硫氢酸铵法，用于测定鞣质、生物碱及含有,Ca,2+,、,Mg,2+,、,Fe,3+,，,Hg,2+,等矿物类制剂的含量,氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质。,是中药及其制剂含量测定的常用方法，具有灵敏度高，精度好，造作简单等优点。,要求被测组分本身或其显色产物对可见,-,紫外光具有选择性吸收。,按测定波长不同可分为单波长光度法和计算分光光度法。,二、可见,-,紫外分光光度法,（一）单波长光度法,测定前，必须经过适当的提取，净化，或采用专属的显色反应等步骤来排除,干扰。,选择,max,进行定量分析，而共存组分在此波长处基本无吸收。,吸收度读数控制在,0.3-0.7,之间。,1.,吸收系数法,按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于,100,，并注意仪器的校正和检定。,2,对照品比较法,按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的,100,10,所用溶剂也应完全一致。,3.,标准曲线法,先配制一系列浓度不同浓度的对照品溶液,在相同条件下测定吸收度,绘制,A/C,曲线或求出其回归直线方程（,r0.999,）,即得标准曲线。在相同条件下测定供试品的吸光度,求得供试品中被测组分的浓度或含量,.,在比色法中最常用,.,（二）计算分光光度法,供试液中若有两种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多个波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分的干扰，测定其中某个组分。,三,.,薄层色谱扫描法,系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查或含量测定。,同,HPLC,相比：具有实验成本低，流动相的选择与更换方便等优点,是药物制剂中常用的分析方法之一,2005,版,中国药典,中有,35,中中成药的含量测定才有薄层扫描法,（一）基本原理,一般是指波层色谱斑点的色谱扫描,固定波长，斑点移动，测定,A-l,或,F-l,曲线,根据波层扫描的测定方式可分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法,1.,薄层吸收扫描法,适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分，可分别以氘灯和钨灯为光源，在,200-800nm,波长范围内选择合适波长进行测定。,斑点中物质的浓度与吸光度的关系需要用,Kubelka-Munk,理论及曲线来描述,Kubelka-Munk,理论以斑点的相对反射率和相对透光率表示薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数,SX,对斑点中物质的浓度与吸收度间关系的影响，从而获得不同散射参数,SX,时斑点的,A-KX,理论曲线，即,Kubelka-Munk,曲线。,Kubelka-Munk,曲线时薄层扫描法进行定量分析的理论依据,2.,薄层荧光扫描法,适用于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定，光源用讪灯或汞灯，采用直线式扫描。,专属性强，灵敏度比吸收法高,1-3,个数量级，最低可测到,10-50pg,样品，但使用范围窄,当溶液浓度很稀时,(,ECl,0.05),，荧光强度与激发光强,I,0,及物质的浓度,C,的关系为,F=2.3KI,0,ECl,或,F=KC,K,为常数（与荧光效率有关），,L,为薄层板厚度，,E,为吸光系数,Kubelka-Munk,理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直,用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强的的积分值与斑点中组分的含量代替上式中的,F,与,C,进行运算。,（二）定量分析方法,1.,方法学考察,（,1,）工作曲线,目的是：,检验所选择的散射参数,SX,是否合适,考察工作曲线是否通过原点，以便确定采用一点法或两点法定量,确定点样量的线性范围,（,2,）分离度：,用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离（,R,）的计算公式为：,R=2,（,d,2,-d,1,）,/(W,1,+W,2,),式中：,d,2,为相邻两峰中后一峰与原点的距离；,d,1,为相邻两峰中前一峰与原点的距离；,W1,及,W2,为相邻两峰各自的峰宽。,除另有规定外，分离度应大于,1.0,。,（,3,）重复性,同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于,3.0%,；需显色后测定的相对标准偏差应不大于,5.0%,。,（,4,）准确度考察,常用加样回收率来衡量，其值应在,95%-105%,之间，测定数据一般为,5-6,个,（,5,）统计检验,包括,F,检验和,t,检验,2.,定量方法,（,1,）外标法,（,2,）内标法,（,3,）回归曲线定量法,外标一点法,外标两点法,四、气相色谱法,（一）基本原理,气化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间的作用不同，在色谱柱中移动有快有慢，经一定柱长后得到分离，以此被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转化为电信号变化记录为色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析。,(1),色谱柱的理论板数,(n),n,（ ）,t,R,=5.54,t,R,W,1/2,=16,（ ）,t,R,W,（ ）,2.,速率理论,H=A+B/,u+Cu,3.,分离度,2(t,R2,t,R1,),R,W,1,W,2,4.,系统适应性,（,1,）色谱柱的理论塔板数,（,2,）分离度,R1.5,（,3,）重复性,2.0%,（,4,）拖尾因子,0.95-1.05,（二）实验条件的选择,1.,固定相的选择,2.,柱温的选择,3.,载气的选择,4.,其他条件的选择,5.,检测器,（三）定量分析方法,（,1,）内标法加校正因子,（,2,）外标法,（,3,）归一法,（,4,）标准溶液加入法,五、高效液相色谱法,（一）基本原理,(1),色谱柱的理论板数,(n),n,（ ）,t,R,=5.54,t,R,W,1/2,=16,（ ）,t,R,W,（ ）,2.,速率理论,H=,A+Cu,（二）实验条件的选择,.,色谱柱选择,.,流动相选择,.,洗脱方式,.,检测器,.,前处理,（三）法分类及方法,.,键合相色谱法,.,胶束色谱法,.,反相键合相色谱,.,正相键合相色谱,.,离子对色谱法,.,离子抑制色谱法,六、荧光分析法,七、原子吸收分光光度法,定量分析方法的特点,一、容量分析法,用原料药精制品,(,含量,99.5,),或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于,0.2,；进行回收率试验。,回收率一般在,99.7,100.3,之间,。,(,一,),容量分析法的特点,(,二,),容量分析法的计算问题,二、光谱分析法,(,一,),UV-,可见分光光度,法,用适当浓度的精制品进行测定，其,RSD,一般不大于,1,。,制剂的,测定,，回收率一般应在,98,102,之间。,线性：,吸光度,A,一般在,0.2,0.7,，浓度点,n,5,。,用浓度,c,对,A,作线性回归处理，得一直线方程，,r,应大于,0.999(n,5),，,方程的截距应近于零。,(,二,),荧光分析法,1.,特点,2.,荧光分析仪,3.,含量测定,三、色谱分析法,(,一,) HPLC,法：要求,RSD2,，,回收率,98,102,之间。,线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点,n,应为,5,7,，用浓度,c,对峰高,h,或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，,r,应大于,0.999,，截距应趋于零。,专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除,(,二,),气相色谱法,1.,对仪器的一般要求,2.,系统适用性试验,3.,测定法,第三节 药品质量标准分析方法验证,一,),目的,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,二,),用 途,（一）药品质量标准起草时，分析方法需,经验证。,（二）药物合成方法变更、制剂的组分,变更、原分析方法进行修订时，,分析方法需经验证。,三,),需验证的分析项目,1.,鉴别试验；,2.,杂质定量或限度检查；,3.,原料或制剂中有效成分含量测定；,4.,制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；,5.,溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。,验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,四,),验证内容,一、,准确度（,accuracy,）,准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。,测定回收率,R,（,recovery,）,的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,回收试验,空白,+,已知量,A,的对照品（或标准品）测定，测定值为,M,加样回收试验,已准确测定药物含量,P,的真实样品,+,已知量,A,的对照品（或标准品）测定，测定值为,M,数据要求,规定的范围内，至少用,9,次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,1.,含量测定方法的准确度,原料药可,用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。,制剂,可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。,如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。,中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在,95,105%,范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在,90,110%,范围内。,RSD,一般在,3%,以内。,2,杂质定量测定的准确度,可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。,二、,精密度（,precision,）,精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（,d,）、,标准偏差,(,SD,),、,相对标准偏差,(,RSD,),（,变异系数，,CV,）,表示。,偏差（,d,）,：,测量值与平均值之差,标准（偏）差（,SD,或,S,）,相对标准（偏）差（,RSD,）,，,也称变异系数（,CV,）,1.,重复性,在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用,9,次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作,100%,，至少测,6,次进行评价。,2.,中间精密度,同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备,3.,重现性,不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,三、,专属性（,specificity,）,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。,四、,检测限（,limit of detection,，,LOD,）,检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用,%,、,ppm,、,ppb,表示。,1,非仪器分析目视法,用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,2,信噪比法,用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（,S/N,）,31,或,21,时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。,3,数据要求,应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限,（,1imit of,quantitation,，,LOQ,）,指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用,%,、,ppm,、,ppb,表示。,常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（,S/N,）,为,101,时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（,SD,）,的,10,倍为估计值，再经试验确定。,六、,线性,在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。,数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。,七、范围,指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,八、 耐用性,指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。,2.,杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。,3.,含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。,（九）应用,1.,鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。,99,：,73.,精密度是指（,B,）,A.,测得的测量值与真值接近的程度,B.,测得的一组测量值彼此符合的程度,C.,表示该法测量的正确性,D.,在各种正常试验条件下，对同一,样品分析所得结果的准确程度,E.,对供试物准确而专属的测定能力,99x,：,76,精密度是指该法（,D,）,A.,测得的测量值与真值接近的程度,B.,测得的测量值与回收率接近的程度,C.,测量的正确性,D.,测得的一组测量值彼此符合的程度,E.,对供试物准确而专属的测定能力,96,：,138,在药物分析中，精密度是表示该法的（,BD,）,A.,测量值与真值接近程度,B.,一组测量值彼此符合程度,C.,正确性,D.,重现性,E.,专属性,95,：,106,110,应要求的效能指标：,A.,检测限,B.,定量限,C.,两者均要求,D.,两者均不要求,95,：,106.,含量测定方法评估（,D,）,95,：,107.,杂质限量检查（,A,）,95,：,108.,杂质定量测定（,B,）,95,：,109.,溶出度测定（,D,）,95,：,110.,中间体含量测定（,D,）,97,：,126,药物杂质检查所要求的效能指标为（,CDE,）,A.,准确度,B.,精密度,C,选择性,D.,检测限,E.,耐用性,98,：,138,评价药物分析所用的测定方法的效能指标有（,BCD,）,A.,含量均匀度,B.,精密度,C.,准确度,D.,粗放度,E.,溶出度,例,1,5,A,精密度,B,定量限,C,两者皆是,D,两者皆不是,1.,某法测得一组测量值间彼此符合程度（,A,）,2.,测量值和真值接近的程度（,D,）,3.,测定结果的重现性（,A,）,4.,可定量测得被测药物的最低水平参数（,B,）,5.,药物分析方法的效能指标（,C,）,例,6.,相对标准差表示（,C,）,A.,准确度,B.,回收率,C.,精密度,D.,纯净度,E.,限度,例,7.,精密度的一般表示方法有,(,AE),A.,相对标准差,B.,相对平均偏差,C.,相对误差,D.,绝对误差,E.,标准差,例,8.,检测限的表示方法有（,ABC,）,A.,百分数,B.,ppm,C. ppb,D. g,E.,ng,例,9.,用信噪比法表示检测限时，信噪比一般应为（,BC,）,A. 1,1,B. 2,1,C. 3,1,D. 4,1,E. 5,1,例,10.,用碘量法测定维生素,C,原料药时，要求碘量法应具备（,ACD,）,A.,选择性,B.,定量限,C.,精密度,D.,粗放度,E.,线性,例,11.,测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求,(,ACD),A.,精密度,B.,定量限,C.,耐用性,D.,回收率,E.,检测限,例,12.,药物鉴别试验所要求的效能指标为（,CE,）,A.,准确度,B.,精密度,C.,选择性,D.,检测限,E.,耐用性,生物样品分析时，常用,RSD,表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。,批内精密度,：,是同一次测定的精密度。所得,RSD,应争取达到,5,以内，但不能超,10,。,批间精密度,：,是不同次测定的精密度。所得,RSD,应控制在,15,以内。,附录,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则,规定一般,RSD,应小于,15%,，在,LOQ,附近,RSD,应小于,20%,。,