质粒DNA的双酶切

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、实验目的,通过本实验让学生掌握质粒,DNA,双酶切的原理和操作方法,二、实验原理,限制性内切酶是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。每一种内切酶能识别,DNA,分子中由,4,6,个核苷酸组成的特定序列,多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来,DNA,分子的重要手段。细菌细胞内的,DNA,由于相应序列上的,A,或,C,碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外源,DNA,一旦进入细胞则立即被识别，双股,DNA,螺旋都被切断，,这种现象被称为,寄主控制的限制与修饰现象,限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶,限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：,型、,型和,型,型限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,DNA,分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析,DNA,结构或克隆基因。这类酶如,Eco,B,、,Eco,K,等,型限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸，少数也有识别,5,个核苷酸以及,7,个、,8,个、,9,个、,10,个和,11,个核苷酸的。,型限制性内切酶的识别顺序是一个,回文对称顺序,，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端,：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,EcoRI,的识别顺序为：,5,G,AA|TTC,3,3,C T,T|AA,G,.5,|,表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是,GAATTC,或,CTTAAG,，这就是回文顺序。,表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个,DNA,片段，各有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而“粘合”,平头末端,：,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV,的识别位置是：,5,GAT,|,ATC,3,3,CTA,|,TAG,5,切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来,型,限制性内切酶,也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆,影响限制性内切酶活性的因素：,DNA,的纯度,DNA,的甲基化程度,酶切消化反应的温度,DNA,的分子结构,溶液中离子浓度及种类,缓冲液的,pH,值,双酶切的两种酶介绍,Xho,酶（,TaKaRa,公司）,识别序列和切割位点：,Eco,R,酶,（,TaKaRa,公司）,识别序列和切割位点：,三、仪器、材料与试剂,水浴锅,移液枪和枪头,制冰机,浮板,R-pGEX-4T-1,质粒,DNA,Xho,酶,Eco,R,酶,10H Buffer,无菌水,小离心管,四、实验步骤,质粒,DNA,的双酶切,反应体系：,反应条件：,温度,37,，酶切,1.5h,琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,紫外线投射仪观察结果,UVP,凝胶成像系统记录结果（电泳图）,Eco,R,1,L,Xho,1,L,10H Buffer,2,L,质粒,DNA,10,L,12,L1,g,无菌水,6,L,4,L,总体积,20,L,（无菌水补至总体积）,五、思考题,型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎样的末端？,影响限制性内切酶活性的因素有哪些？,？,