生化药物制造工艺酶类药物

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节酶类药物,一、酶类药物的原料来源,（一）原料选择,选料应注意以下几点：,（1）不同酶的,原料选择,。,（2）注意不同,生长发育情况及营养状况,：微生物制酶，故需,测其活力,来决定,取酶阶段,。要考虑动物,年龄及饲养条件,等因素；,（3）从原料来源是否丰富考虑,；,（4）从简化提纯步骤着手。,（5）如用,动物组织,作原料，则此动物,宰杀后应立即取材,。,从,动物或植物,中提取酶受到,原料的限制,。,用,微生物发酵法,生产,药用酶,，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。,（二）微生物酶制剂高产菌株的选育,菌种是工业发酵,生产酶制剂,的重要条件。,目前，,优良菌种,的获得有,三条途径,：,是从自然界,分离筛选,；,是用,物理或化学方法,处理、,诱变,；,是用,基因重组与细胞融合技术,。,微生物的,分离筛选,是一切工作的基础。,（三）微生物酶制剂生产的发酵技术,有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件，要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的,最适培养条件,。首先要,合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量,等。,在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件，如培养基的,灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制,等。,还要研究酶的,分离提纯技术,和制备工艺，这些条件的,综合结果,将决定,酶生产,本身的经济效益。,二、酶类药物的提取和纯化,（一）生物材料的预处理,一般应,避免剧烈处理,，但如是,结合酶,，则必须进行,剧烈处理,。,1、动物材料的预处理,（1）机械处理,用绞肉机绞，一般,细胞并不破碎,，而有的酶,必须细胞破碎,后才能有效地提取，因此须采用,特殊的匀浆,才行。,在实验室常用的是,玻璃匀浆器和组织捣碎器,。,工业上可用,高压匀浆泵,。,（2）反复冻融,由于细胞中,冰晶的形成,，及剩下液体中,盐浓度的增高,，能使,细胞中颗粒及整个细胞破碎,，从而,使某些酶释放,出来。,（3）丙酮粉,组织经丙酮,迅速脱水干燥制成丙酮粉,，不仅可,减少酶的变性,，同时因,细胞结构成分的破碎,使,蛋白质与脂质,结合的,某些化学键打开,，促使某些,结合酶释放,到溶液中，真空干燥即得,丙酮粉,。,丙酮粉在,低温下,可,保存数年。,2、微生物的预处理,要是酶是,胞外酶,，则可,除去菌体,后,再直接从发酵液中吸附提取酶。但对,胞内酶,则需,将菌体细胞破壁,，制成,无细胞的悬液,后再行提取。,（1）干燥法,干燥方法很多，常见有,空气干燥、真空干燥和冷冻干燥,三种。,（2）机械法,常用的方法有,研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法,等。,（3）酶法处理,用得最多的是,溶菌酶,，也有用,脱氧核糖核酸酶处理,，操作与溶菌酶同。,（二）酶的提取,一般在提取前，应通过,调查研究，文献检索，详细了解欲提取酶的性质,。,提取方法主要有,水溶液法，有机溶剂法和表面活性剂,法三种。,1、水溶液法,常用,稀盐溶液或缓冲液提取,。为了防止提取过程中酶活力降低，一般在,低温下操作,。,2、有机溶剂法,某些,结合酶,如,微粒体和线粒体膜的酶,，由于和脂质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须,除去结合的脂质,，且不能使,酶变性,。,最常用的有机溶剂是,丁醇,。,丁醇具有下述性能：,亲脂性强,，特别是亲磷脂的能力；,兼具亲水性,，在0在水中的溶解度为10.5；,在,脂与水分子间,能起,类似去垢剂的桥梁作用,。,3、表面活性剂法,表面活性剂分子具有,亲水性的或疏水性,的原子基团。,表面活性剂能与蛋白质结合,而分散在溶液中，故可用于,提取结合酶,，但此法用得较少。,（三）酶制剂的工业提取法,工业生产的酶有,二种剂型,液体制剂和粉剂,1、发酵液的预处理及过滤,现在,处理方法,是，在发酵液中加,絮凝剂或凝固剂,。,微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转鼓式,真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机,。,2、酶液的脱色,工业上廉价的脱色剂是,活性炭,，用量通常为,0115,。,目前工业上大规模使用,脱色树脂,国内生产的几种,脱色树脂,，效果都较好。,3、盐析法,盐析法的,优点,是在,常温下,不会造成酶的失活，若,分级沉淀应用,得当，杂蛋白杂质也较少，适用于,多种酶沉淀,。,4、有机溶剂法,用有机溶剂沉淀蛋白质及用,分级沉淀法,纯化蛋白质。工业上通常采用,乙醇作为沉淀剂,。,5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂,喷雾干燥,有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难过,温度这一关,。,喷雾干燥,用于,菌体干燥,，而,药用酶常用冷冻干燥,。,除上述方法外，工业上,提取酶制剂,的方法还有,丹宁沉淀法,、,白土活性氧化铝吸附法、,pH,或加热沉淀法、蛋白质表面变性法,等。,（四）酶的纯化,酶的纯化。评价主要看二个指标，一是,酶比活，二是总活力回收,。,本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些,技术难点。,1、杂质的除去,酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的,杂蛋白、多糖、脂类和核酸,等。,（1）pH和加热沉淀法,利用,蛋白质酸碱变性性质,的差别可以通过,调pH和等电点,除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳定的差异，使,杂蛋白变性,而沉淀。,（2）蛋白质表面变性法,利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白。例如：加入,三氯甲烷和乙醇,进行震荡，可以,除去杂蛋白,。,（3）选择性变性法,利用,蛋白质稳定性,的不同，除去杂蛋白。甚至可用,25三氯乙酸,处理，这时其他,杂蛋白都变性,而沉淀。,（4）核酸沉淀剂法,在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此，可用,核酸酶,，将,核酸降解成核苷酸,。,也可用一些,核酸沉淀剂,如,二甲基十六烷基溴化铵,、,硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰,等：,（5）将酶与底物结合,，,酶和底物结合或竞争性抑制剂,结合后,，稳定性大大提高，这样就可用,加热法除去杂蛋白,。,2、脱盐和浓缩,（1）脱盐,酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要脱盐。最常用的脱盐方法是,透析和凝胶过滤,。,（2）浓缩,酶的浓缩方法很多，有,冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水,等。,3、酶的结晶,把酶提纯到一定纯度以后（通常,纯度应达50以上,），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，,酶的纯度,经常有一定程度的,提高,。,酶的结晶既是提纯的结果，也是,提纯的手段,，此外，为研究蛋白质空间结构,提供射线衍射样品,，也是酶的结晶的,重要目标,之一。,（1）酶的结晶方法,酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其,略处于过饱和状态,。,改变酶溶解度,的方法很多，一般,新样品,往往要使用,几种方法,才能得到结晶。,盐析法。,在适当的,pH,、,温度,等条件下，保持酶的稳定，慢慢,改变盐浓度,进行结晶。,结晶时采用的盐有,硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸镁和甲酸钠,等。,有机溶剂法,。,酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。,结晶用的有机溶剂有：,乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二恶烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷,等。用有机溶剂法,易引起酶失活,。,复合结晶法,。,有时可以利用,某些酶,与,有机化合物或金属离子,形成,复合物或盐,的性质来结晶。,透析平衡法。,对一定的,盐溶液或有机溶剂,进行透析平衡，这时酶液可,缓慢地达到过饱和,而析出结晶。,等电点法。,一般地说，在,等电点附近酶的溶解度很小,，这一特征为酶的,结晶条件,提供了理论根据。,（2）结晶条件的选择,在进行,酶的结晶,时，要选择一定,条件与相应的结晶方法,配合。这不仅为了能够得到结晶，也是为了保证不引起,酶活力丧失,。,影响酶结晶因素很多，下列几个条件尤为重要：,酶的纯度,。,总的来说酶的,纯度越高，结晶越容易,，长成,大的单晶,可能性也越大。,酶的浓度,。,结晶母液通常应,保持尽可能高的浓度,。酶的,浓度越高,越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，,形成结晶的机会也越大,，对大多数酶来说，蛋白质浓度为,510mgml,为好。,温度,。,结晶的温度通常在,4下或室温25下,，低温条件下酶不仅,溶解度低,，而且,不易变性,。,时间,。,结晶形成的时间长短不一，从,数小时到几个月,都有，有的甚至需要,1年或更长时间,。,pH,。除沉淀剂的浓度外，在结晶条件方面,最重要的因素是pH,。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的,等电点附近,。,金属离子,。许多,金属离子,能引起或有助于,酶的结晶，,在,二价金属离子,存在情况下，有,促进结晶长大作用,。,晶种,。不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶。生长大的单晶时，也可引入晶种。,结晶器皿处理,。结晶用的器皿要,充分清洗、烘干,。使用前用,结晶母液再冲洗一次,，也可用,压缩空气或惰性气体吹去灰尘,。,用于长结晶的玻璃器皿，可用,硅涂料进行表面处理,，以使,表面光滑且不润湿,。这样可,减少晶核数目,，有助于形成大的单晶。,4、酶分离和纯化工作中的注意事项,酶是蛋白质，一般,不太稳定,。提纯过程中，,酶纯度越高，就越不稳定,，酶分离纯化时尤其要,注意以下几点：,（1）防止酶蛋白变性,为防止酶蛋白变性，应避免,pH过高或过低,，应,避免高温。,一般要在,中性pH和低温（4左右）下操作,。为防止酶蛋白的,表面变性,，,不可剧烈搅拌,，以免,产生泡沫,。应避免,酶和重金属,或其他蛋白变性剂接触。如要用有机溶剂处理酶液，操作尽可能在,低温下，短时间内,进行。,（2）防止辅因子的流失,有些酶除酶蛋白外，还含有,辅酶、辅基和金属等辅因子,。在进行,超滤、透析,等操作时，要,防止这些辅因子的流失,。,（3）防止酶被蛋白水解酶降解,在提取液尤其微生物培养液中，常常同时存在一些,蛋白水解酶,，要及时采取有效措施将它们除去。,如果操作时间长，还要,防止杂菌污染酶液,，造成所需要,酶的失活,。,三、重要酶类药物的制备,（一）药用酶类的概述,现在国内外已广泛应用于多种疾病的治疗，其,制剂品种,已超过,700余种,。,1、与治疗胃肠道疾病有关的酶类药物,利用酶作为,消化促进剂,，早已为人们所采用。,2、消炎酶类,3、,与纤维蛋白溶解作用有关的酶类,4、抗肿瘤的酶,5、其它药用酶,1、胃蛋白酶,（Pepsin，EC3.4.4.1）,胃蛋白酶,广泛存在于哺乳类动物的,胃液,中，药用胃蛋白酶系从,猪、牛、羊,等家畜的,胃粘膜中提取,。,（1）组成（结构）、性质,药用,胃蛋白酶,是胃液中,多种,蛋白水解酶,的,混合物,，含有,胃蛋白酶,、,组织蛋白酶,、,胶原酶,等，为粗制的酶制剂。,水溶液呈,酸性,，难溶于,乙醇、氯仿,等有机溶剂。,pI为pH1.0,，,最适pH1.52.0,。,可溶于,70乙醇和pH4的20乙醇中。,胃蛋白酶,能,水解大多数天然蛋白质,底物。,（2）生产工艺,1）工艺路线：,胃蛋白酶原,盐酸,催化,激活,成,胃蛋白酶,。,常用的,脱脂剂,有,乙醚,、,氯仿,、,四氯化碳,。,2）工艺过程：,3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺,：向经,消化,、,提取,、,脱脂,、,分层,、,浓缩,及,60丙酮沉淀,分离,胃膜素,的,母液中,，边搅拌边加,冷丙酮,，至,比重为0.91,，即有,淡黄色胃蛋白酶,沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得,胃蛋白酶,。,4）结晶胃蛋白酶的制备,：药用胃蛋白酶原粉，溶于,20酒精,中，加H,2,SO,4,调,pH3.0,，5静置20h后过滤，加,硫酸镁,至饱和，进行,盐析,。盐析物再在,pH3.84.0的乙醇中,溶解，过滤，滤液用,硫酸调pH至,1.82.0,，即析出,针状胃蛋白酶,。沉淀再溶于,20%pH4的乙醇,中，过滤，滤液用硫酸调,pH至1.8,，在20放置，可得,板状或针状,结晶。,2、胰蛋白酶,胰蛋白酶,是从,牛、羊胰脏,提取、结晶的冻干制剂。,（1）化学组成与性质,易溶于水,，,不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂,。在,pH1.8,时，,短时煮沸,几乎不失活；在,碱溶液,中加热则变性沉淀，,Ca,2+,