突变体库反馈信息

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2011-9-8,#,关于突变体库的反馈信息,Shm,201109,一元载体、二元载体构建的原理及适用范围？,DNA,四个碱基是怎么组合的？,增强子捕获、启动子捕获可否再详细些？,突变体库数量的计算方法？,1.,一元、二元载体构建的原理及适用范围？,一元载体构建的基本,原理：,外源基因首先克隆到一个克隆载体上，该载体含有一段与缺失,T-DNA,的,Ti,质粒有同源序列，当该载体进入土壤农杆菌后，与,Ti,质粒整合，然后由,Ti,质粒提供,T-DNA,向植物细胞转移的,vir,基因产物。,二元载体构建的基本原理：,vir,区与,T-DNA,区具有不同的功能，它参与,T-DNA,的转移与整合到植物细胞基因组的作用。利用这一特点，可将带有外源目的基因的,T-DNA,和,vir,区安置在不同的质粒载体上进行操作。,同源重组,2.DNA,四个碱基是怎么组合的？,2.1,核酸的组成,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,碱基种类和结构,DNA,与,RNA,核苷,(ribonucleoside),的形成,碱基和核糖（脱氧核糖）通过,糖苷键,连接形成核苷（脱氧核苷）。核苷：,AR,GR,UR,CR,（,2-,脱氧核苷：,dAR,dGR,dTR,dCR,）,H,核苷酸,(ribonucleotide),的结构,核苷（脱氧核苷）和磷酸以,磷酸酯键,连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸：,AMP,，,GMP,，,UMP,，,CMP,（,2-,脱氧核苷酸：,dAMP,，,dGMP,，,dTMP,，,dCMP,）,(A,G,C,T),N,H,核酸的结构,核苷酸之间以磷酸二酯键（,3,5,）连接形成多核苷酸链，即核酸（一级结构）。,核酸的一级结构,核酸的二级结构,B-DNA,双螺旋结构模型要点（,Watson,Crick,1953,）,两条反向平行的互补多核苷酸链围绕一个中心轴盘绕成右手双螺旋结构；,右手螺旋结构，深浅沟各一；,螺旋直径,2.0nm,，每十个核苷酸转一周，螺距,3.4nm,；,磷酸脱氧核糖构成双螺旋骨架位于外侧，碱基位于内侧。碱基平面垂直于螺旋轴；,双螺旋两条链间的碱基通过氢键相链，保持双螺旋稳定。,A-T,间两条氢键、,G-C,间三条氢键。,B-DNA,双螺旋结构模型要点（,Watson,Crick,1953,）,A,B,Z,外型,粗短,适中,细长,螺旋方向,右手,右手,左手,螺旋直径,2.55nm,2.37nm,1.84nm,碱基轴升,0.23nm,0.34nm,0.38nm,碱基夹角,32.7,34.6,60,每圈碱基数,11,10.4,12,螺距,2.53nm,3.54nm,4.56nm,碱基倾角,19,1,9,活性,次之,最高,最低,增强子捕获：,报告基因与最小启动子融合，典型的最小启动子，含,T A T A b o x,及转录起始位点，但不能单独驱动报告基因的表达，若被插入位点附近的增强元件激活，则可导致报告基因的表达。,3.,增强子捕获、启动子捕获和基因捕获,启动子捕获：,用不带启动子的报告基因，随机插入染色体中，由插入位点附近基因的启动子启动报告基因表达，通过检测报告基因是否表达、以及报告基因在生物体中的表达部位，可以判断报告基因插入位置附近是否有基因的启动子存在以及该基 因的表达是否有特异性。,基因捕获：,载体的报告基因之前含一个或多个剪切受体序列，报告基因前也无启动子，只有插在一个转录单位之内且方向正确时才能表达。,增强子捕获不受插入位置的限制，可导致报告基因高频率地表达；启动子捕获及基因捕获含有一个无启动子的报告基因，所 以只有当插入发生在转录单位且方向正确时报告基因才能表达，相比增强子捕获更可能导致基因失活。,突变体库数量的计算方法？,P=1-(1-(L/C),nf,P:,发现任意一个基因插入突变的概率；,L:,基因的平均长度；,C:,单倍体基因组的大小；,n:,是插入突变的株系数；,f:,是每个株系平均插入位点数。,水稻中，,C=4.3,*,10,8,bp,，,L=3kb,，,f=1.4,，理论上饱和突变体库的,P,值为,1,，以,95%,的概率发现任意一个基因的突变，需要一个包含,306000,个株系的突变体库。,水稻耐淹与深水稻基因的克隆和遗传分析,一、研究背景与意义,亚洲（,30%,）、非洲（,40%,）的水稻种植为浅水稻（,1550cm,）或深水稻（,50cm,）；,在一些雨水充沛的国家和地区，在水稻的生长季节中，通常水平面逐渐上升至几米或遇到洪水将水稻完全淹没的现象，一般的高产水稻品种在完全淹没一星期基本都死亡；,克隆相关基因，进行分子聚合育种，培育既能耐淹避淹又高产的水稻品种。,二、相关基因的克隆与功能分析,1.Sub1A,（,Submergence 1,）,1.1,定位群体的构建与基因克隆,大部分的栽培稻（品种）在完全淹没一周后死亡；,FR13A,，籼稻品种，在完全淹没（水的浑浊度、温度及光照有关）两周后仍能存活并继续生长发育；,FR13A,与不耐淹的粳稻,M-202,杂交，获得,4022,株定位单株，图位克隆，将,Sub1,位点定在,9,号染色体着丝粒附近，该位点具有三个基因，,Sub1A,、,Sub1B,与,Sub1C,。,1.2,Sub1,位点的基因结构和相关基因淹没的诱导表达,Sub1,基因在耐淹籼稻（,IR40931-26,）与不耐淹粳稻（,Nipponbare,）的结构,在淹没十天和恢复三天的过程中对两个亲本基因转录本进行半定量,RT-PCR,分析,1.3,Sub1A-1,在转基因水稻中淹没诱导下的表达情况,株高的比较,Northern blot,analysis,，淹没恢复,10,天后检测,1.4,通过分子辅助选择将,Sub1A-1,导入到不耐淹的水稻品种中,将生长,14,天的苗完全淹没,14,天，解除淹没后,14,天的照片,通过,QTL,和,Mapping,克隆了水稻耐淹基因,Sub1A-1,，,位于,9,号染色体,；,该基因编码一类,ERF,蛋白，在淹没诱导下表达，基因功能缺失突变体在淹水情况下通过调节,SLR1,、,SLRL1,的表达进而抑制植株生长；,是一类逆境适应基因，对水稻功能基因组学研究与分子育种意义重大。,1.5,小结,2.,SNORKEL1,与,SNORKEL2,分布,主要在东南亚、孟加拉国、印度等国，中国暂时没大面积有种植深水稻的报道；,生存条件,深水稻一般生长在,16m,深的水中，通常不会超过,8m,，最浅的约为,50cm,，深水稻的茎可长达,56m,，主要条件取决于水位、光照和土壤三大因素；,特征特性,具有强烈的光敏感，在一定的水深和光照条件下开花，种子容易脱落，种子在光照和水深适宜的条件下发芽，其休眠期可长达数周；,产量,平均产量为,300 400,斤,/,亩左右。,2.1,深水稻,C9285,一个典型的深水稻品种；,在,T65,与,C9285,杂交的后代检测到,3,个,QTL,，分别位于,1,、,3,与,12,号染色体，其中位于,12,号染色体的效应最大；,发展一个以,T65,为背景的带有,C9285,的,12,号染色片段的近等基因系，以此克隆到了,SNORKEL1,与,SNORKEL2,。,2.2,SNORKEL1,与,SNORKEL2,的定位,2.3,SNORKEL1,、,SNORKEL2,的克隆及表达,深水反应（,b,与,c,为十叶期的水稻浸没两周后）,d.,SK1,、,SK2,的基因结构；,e.AP2/ERF,；,f.,SK1,、,SK2,基因的表达；,g.,SK1,、,SK2,器官的特异表达；,h.,SK,基因的过表达实验。,2.4,SNORKEL1,、,SNORKEL2,的分子特性,SK1,、,SK2,在洋葱表皮细胞的亚细胞定位,酵母中的转录活性分析？,c.,植物激素对,SK,基因表达的影响；,d.,凝胶迁移滞后实验；,e.,乙烯在深水稻中促进节间伸长（非深水条件）；,f.,有乙烯抑制剂的时节间的伸长；,g.,深水条件下乙烯含量的测定。,2.4,赤霉素对深水反应的效应与分子机制,a.,深水条件下,C9285,中,GA,1,的含量；,b.GA,在,C9285,中的应答反应。,2.5,SK,基因的分布及其,QTL,加性效应,a.,不同品系的深水反应；,b.,不同栽培稻与野生稻中的,SK,基因结构；,c.,近等基因系中深水反应与加性效应。,水稻育种中的,QTL,加性效应,通过,QTL,、,Positional cloning,和获得功能分析克隆到了适应深水环境（避淹）基因,SNORKEL1,与,SNORKEL2,，,位于,12,号染色体,；,乙烯信号因子，该基因主要在茎杆和叶片中表达，突变体在淹水情况下诱导表达，通过抑制,ABA,的合成增加,GA,的量而促进植株的伸长生长；,为水稻适应逆境生理机制提供新的理论依据，对水稻功能基因组学研究和分子育种意义巨大。,2.6,小结,水稻中乙烯与植株耐淹作用机制,谢谢大家！,