第二章_毛细管电泳的理论基础

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 毛细管电泳的理论基础,v,离子迁移速度,e,电泳迁移率，单位电场下离子的移 动速度,2.1电泳,电泳分离是基于组分在电场下的迁移速度不同而进行,的。离子在电场下的移动速度为：,对于给定的离子、介质和温度，迁移率是常数,在,稳定的电泳状态下电场力和摩擦力大小相等、方向相反，即：,（,2.5）,将,方程（2.5）中的,v,代入方程（2.1）得,（,2.6）,方程（2.6）表明半径小、电荷高的组分具有大的迁移率，而半径大、电荷低的组分具有小的迁移率。,在通常的物理参数表中查到的是无限稀释完全电离条件下的电泳迁移率（绝对迁移率），实验中测得的迁移率称为有效迁移率，与缓冲溶液组成、,pH,值,等有关。,2.2电渗及电渗控制,一.电渗,电渗是由于外加电场对管壁溶液双电层的作用而产生的溶液的整体流动，其大小与毛细管壁表面电荷有关。,对石英毛细管，管壁表面带负电，溶液中的对离子被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动。,在,pH,大于3时，电渗不可忽视。电渗在各种电泳模式中均存在，但在,CE,中由于采用了细内径的毛细管，毛细管的表面积比较大，且使用高电场，因此电渗显得特别重要。,电渗的大小用电渗速度或电渗迁移率表示：,在毛细管中电渗流的一个重要特性是平流型的。电渗速度的径向分布如图：,0 5 10 15 20,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0,X(nm),v,eo,(X):,离管壁距离为,X(nm),时的电渗流,电渗的另一个特点可以使几乎所有的组分不管电荷大小，以同样的方向移动。组分在毛细管中流出时间 取决于电渗速度和组分迁移速度的矢量和。一般情况下，电渗方向从阳极到阴极,且电渗速度一般大于电泳速度，所以阴离子也在阴极流出。因此，阳离子、阴离子、中性分子能够同时分析。,图中：阳离子移动速度=电渗流速度+阳离子电泳速率,中性分子移动速度=电渗流速度,阴离子移动速度=电渗流速度阴离子电泳速率,所以：移动速率,阳离子中性分子阴离子,但对于小离子（钠、钾、氯）分析，组分电泳速率一般大于电渗速率。另外，毛细管壁电荷的改性会使电渗发生变化，在这些情况下，阳离子和阴离子可能向不同的方向移动。,电渗是溶液整体的流动，它不能改变分离的选择性。,二.电渗的控制,电渗是毛细管电泳中的基本操作要素，为了优化分离，往往需要控制电渗流。,电渗流的控制方法,方法,结果,说明,电场强度,正比于电渗,.电场强度降低分离效率和分辨率的降低,.电场强度增加，焦耳热增加,缓冲溶液,pH,值,pH,降低，电渗降低,pH,降低，电渗增加,.改变电渗最方便有用的方法,.可能会引起溶质组分电荷和结构的改变,离子强度或缓冲溶液浓度,离子强度增加，,Zeta,电位降低，电渗降低,.离子强度增加，电流和焦耳热增加,.低离子强度可能存在样品的吸附问题,.导电性与样品不同可能引起峰形畸变,.离子强度低，样品装载量小,温度,温度改变1，黏度变化约2%-3%,.温度由仪器自动控制，常用方法,有机改性剂,改变,Zeta,电位和黏度（降低电渗）,.变化复杂，其影响宜通过实验测定,.可能改变选择性,表面活性剂,改变蔬水性或通过离子相互作用吸附在毛细管壁上,.阴离子表面活性剂使电渗流增加,.阳离子表面活性剂使电渗降低或逆向,会改变选择性,中性亲水性聚合物,通过蔬水性相互作用吸附在毛细管壁上,.通过掩盖表面电荷或增加黏度，降低电渗,共价涂覆,化学键和到毛细管壁上,.可使用多种修饰剂,.涂覆物的稳定性 存在问题,2.3 毛细管电泳原理,一.分离原理,毛细管电泳是基于溶质在电场力的作用下，在装有电泳介质,的毛细管中的迁移速度不同而进行分离的。,根据分离原理不同，可分为五种分离模式：,毛细管电泳模式,分离机理,自由溶液毛细管电泳(,FSCE),根据组分的电泳迁移率不同,毛细管胶束电动色谱(,MECC),根据组分在胶束相和水相的分配系数不同,毛细管凝胶电泳(,CGE),根据组分体积和电荷不同,毛细管等电聚焦(,CIEF),根据组分的等电点不同,毛细管等速电泳(,CITP),根据组分的迁移率不同，与,FSCE,不同的是，它使用两种不同电介质,前三种属于区带电泳，当以缓冲溶液作为载体电解质，即为,FSCE;,以胶束溶液作为载体电解质，即为,MECC;,以凝胶作为载体电解质，即为,CGE.,二.迁移时间和迁移率,组分从进样点迁移到检测点所需要的时间称为迁移时间，等于移动的距离除以速度。在电渗存在时，测得为表观迁移率。,V,施加电压,l,毛细管有效长度,L,毛细管总长,t,迁移时间,E,电场强度,2.4 柱效和分辨率,一.扩散与理论板数,两个电泳区带的分辨率与区带宽度有关，而区带宽度在很大程度上取决于扩散过程。,溶质组分的区带扩展，是由于溶质在介质中的扩散速度不同而引起的。,板高：,在,理想的条件下，在毛细管电泳中，溶质区带扩展的唯一因素是纵向扩展，因此，柱效只要与分子扩散有关：,D,溶质的分子扩散系数,（,2.11）,（,2.12）,（,2.13）,（,2.14）,基线峰宽为,W,对高斯峰：,柱效，用理论板数,N,表示:,方程（2.14）带入方程（2.12）得：,（,2.16）,式（2.16）表明：,（1）高电场可使柱效增加,（2）当毛细管总长与有效长度接近时，柱效与柱长几乎无关。,（3）大分子由于分子扩散系数小，在同样条件下其柱效比小分子大。,实际理论板数可直接从电泳图测得：,二.分辨率,分辨率：,（,2.18）,毛细管电泳的分离主要是由于高柱效而不是高选择性。,两个组分的分辨率也可以用柱效表示：,（2.19）,将,方程（2.16）代入（2.19）并用表观迁移率代替,（,2.20）,当,数值相等，方向相反时，可得无限大的分辨率，,但,分析时间接近无限。,2.5 焦耳热和电场强度优化,一.焦耳热和温度梯度,焦耳热会引起温度和黏度的变化，从而 引起区带的扩展。,柱效和分辩率要求使用高电场，但焦耳热的产生使高电场,使用受到限制。,焦耳热大小取决于功率、毛细管尺寸、缓冲溶液电导率及,电压等有关。,温度的升高除可能破坏样品外，对分离不会引起不利，但,温度梯度对分离不利。热从毛细管壁扩散，因此毛细管中,心的温度高于毛细管壁的温度。,温度梯度一方面可能导致密度梯度，产生自然对流，而对流会使已分离的样品区带重新混合，使柱效降低；另一方面会引起缓冲溶液黏度的变化，从而引起电泳迁移率的变化，导致区带扩展。,毛细管内温度曲线方程为：,（2.21）,由,式（2.21）可知毛细管中心的温度,（,2.22）,如果要计算毛细管中心到周围环境的总温度差，不仅要考虑毛细管的内径，还与毛细管壁厚、聚酰亚胺厚度、环境的热转移系数等有关。总温差为：,（,2.23）,在大部分情况下，毛细管外壁与环境之间的热阻一般比其他热阻大的多，总温差主要取决于（2.23）的最后项，即：,（,2.24）,二、温度梯度曲线引起的方差,焦耳热将导致毛细管内抛物线型的温度曲线，而电泳迁移率受温度影响很大，抛物线型的温度曲线将引起毛细管内抛物线型的速度曲线。,由于抛物线型的温度曲线，溶质在毛细管中心的速率大于接近管壁的速率，因此，如果溶质初始浓度在毛细管横截面上是线形分布，经过一段时间后，毛细管中间的溶质比边上的溶质移动的快，单由于径向扩散作用，曲线顶部的溶质向毛细管壁低浓度区扩散，从而使由于抛物线型的速度曲线引起的扩散降低。,由于温度曲线引起的抛物线型的速度曲线而导致的方差为：,（,2.25）,（,2.26）,三、焦耳热和温度梯度的控制,过热的产生和可能存在的温度梯度表现在柱效随电压的升高而降低；电渗或溶质的迁移率随电压的增加而不成比例的增加；,电流与电压不成线性关系等。,限制焦耳热和温度梯度的方法,方法,作用,降低电场强度,热量成比例降低,降低柱效和分辨率,减少毛细管内径,电流大大降低,降低灵敏度,可能引起样品吸附的增加,减少缓冲溶液离子强度或浓度,电流成比例的降低,可能引起样品吸附的增加,温度控制,恒温并有效的转移毛细管中热量,四、电场强度的优化,为最小值时，,E,为最佳电场强度。,最佳电场强度为：,（,2.27）,2.6 影响柱效的其他因素,一、影响柱效的因素,原因,说明,纵向分子扩散,影响柱效的基本因素,扩散系数小的分子有窄的区带,焦耳热,产生温度梯度，或造成抛物线流型,进样区带长度,进样长度应小于扩散控制区带长度,检测限要求进样长度大于理想进样长度,样品吸附,样品与毛细管壁的作用常会引起拖尾峰,样品与缓冲溶液导电性不匹配,样品导电性大于缓冲溶液：前伸峰,样品导电性低于缓冲溶液：拖尾峰,缓冲溶液液面不在同一平面,由于虹吸作用，使毛细管中的缓冲溶液产生层流流型,检测器体积,应小于峰宽，对在柱,UN,检测，池体积很小,方程（2.14）所定义的方差是假使只有分子扩散导出的。,总方差为：,式中脚标分别为：扩散、进样、温度梯度、吸附、检测、电扩散。,二、进样区带宽度,假设样品溶液一矩形塞进入毛细管，由于进样而引起的方差为：,但,在一般情况下样品直接进入毛细管，对静力学进样：,（,2.29）,（,2.30）,对于电动力学进样引起的方差为：,三、溶质毛细管壁相互作用,石英毛细管壁的吸附主要原因是阳离子溶质 和带负电的管壁的静电作用和疏水基的相互作用。大的表面积与体积比对散热有利，单同时增加了吸附的可能性。,由于吸附而引起的方差为：,（,2.32）,方程（2.32）同时考虑了轴向扩散和吸附脱附动力学，方差与溶质毛细管壁相互作用容量因子关系很大。,有许多方法可以减少溶质与毛细管壁的相互作用：,(1)增加缓冲溶液的浓度，通过降低表面有效电荷减少相互作用，但，高离子强度也可以使电渗降低，从而增加溶质在毛细管中的停留时间，并且增加缓冲溶液浓度因同时增加了电流和焦耳热而受到限制。,可选用两性离子缓冲溶液体系。,(2)限制吸附的另一个方法是采用极端的,pH.,(3),毛细管涂附也是降低溶质吸附的有效方法，它是通过降低相互作用自由能而实现的。,四、电扩散作用,由于样品区带和缓冲溶液导电性之间的差别引起的区带扩展称为电扩散。电扩散主要有以下三个影响：,（1）不对称峰形,（2）溶质的浓缩聚焦（样品的导电性较低）或扩散（样品的导电性较高）,（3）由于某种离子过量引起暂时的等速电泳状态,当溶质区带比缓冲溶液有更高的迁移率时，溶质区带的前沿将是扩展的，后沿将是尖锐的。相反，当溶质区带迁移率比缓冲溶液更小时，溶质区带的前沿将是尖锐的，后沿将是扩展的。当样品的导电性和缓冲溶液导电性相等时，峰行不会畸变。,样品区带,样品区带,样品区带,(a),(b),(c),(,a),样品导电性大于缓冲溶液,(,b),样品导电性等于缓冲溶液,(,c),样品导电性小于缓冲溶液,这类峰形的畸化是由于导电性的差别引起的，在每个区带的电场强度不同。当溶质区带比缓冲溶液具有更高的电导时，区带的电场强度比在缓冲溶液中的低。溶质区带的前沿向迁移方向扩散，当进入缓冲溶液时，遇到更高的电场强度，引起溶质离开区带而向更远处迁移，形成前伸区带。而当从峰后沿扩散到缓冲溶液区带时，也同样受到高电场强度，但因其方向是沿迁移方向的所以扩散溶质聚集在溶质区带内，使峰后沿尖锐。,当溶质区带比缓冲溶液迁移率小时，情况正好相反，出现脱尾峰。中性分子不受导电性影响。,近似定量的描述由于导电性差别而引起的区带扩展为：,虽然这类峰形畸化现象总是存在，但与其它扩散相比较小，可是当样品中所含溶质迁移率范围较宽时，峰的畸化是比较明显的。例如无机离子和有机酸的分离，高迁移率、先流出的离子，出现前伸峰中等迁移率的离子具有接近高斯型的峰。低迁移率、后流出的离子有脱尾峰。,