酶的提取与分离纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 酶的提取和分离纯化,1,、酶的提取与分离纯化技术路线,2,、细胞破碎,3,、酶的提取,4,、酶的分离方法,Go,Go,Go,Go,5,、酶的组合分离纯化策略,Go,6,、酶的浓缩、干燥与结晶,Go,第一节 酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶,提取,酶,分离纯化,酶,浓缩,酶,贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,酶,的纯化过程，约可分为三,个阶段：,(1),粗蛋白质,(crude protein):,采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用,盐析沉淀法,；可以粗略去除蛋白质以外的物质。,(2),部分纯化,(partially purified):,初步的纯化，使用各钟,柱层析法,。,(3),均质酶,(homogeneous):,目标酶的进一步精制纯化，可用,制备式电泳,或,HPLC,。,酶分离纯化不同阶段,本章,目录,第二节：细胞破碎,许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。,1,）机械破碎,2,）物理破碎,3,）化学破碎,4,）酶解破碎,JY92-II D,超声波,细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I,型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法,研磨法,匀浆法,物理破碎,温度差破碎法,压力差破碎法,超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：,甲苯、丙酮,丁醇、氯仿,表面活性剂：,Triton,、,Tween,酶促破碎,自溶法,外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,本章,目录,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于,1mm,）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.,珠磨法（,Bead mill,）,原理：,实验室规模的细胞破碎设备有,Mickle,高速组织捣碎机、,Braun,匀浆器；,中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；,在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士,WAB,公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在,80%,以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,采用,高压匀浆器,（由高压泵和匀浆阀组成，英国,APV,公司和美国,Microfluidics,公司均有产品出售）。,2.,高压匀浆法（,High-pressure homogenization,）,大规模细胞破碎的常用方法,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。,易造成堵塞的团状或丝状真菌，,较小的革兰氏阳性菌，,含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法。,在,15-25 kHz,的频率下操作。其原理可能与空化现象（,cavitation,phenomena,）引起的冲击波和剪切作用有关。,空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。,3.,超声破碎法（,Ultrasonication,）,一般杆菌比球菌易破碎，,G-,细菌比,G+,细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，,该法,在实验室小规模细胞破碎中常用,。,但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,4.,酶溶法（,Enzymatic,Lysis,）,（,1,）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、,-1,，,3-,葡聚糖酶、,-1,，,6-,葡聚糖酶、,蛋白酶、,甘露糖酶、,糖苷酶、,肽键内切酶、,壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质,-,甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序,。,酶溶法的优点：,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。,在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。,影响自溶过程的主要因素有温度、时间、,pH,值、激活剂和细胞代谢途径等。,缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（,2,）自溶法（,Autolysis,）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,4.,化学渗透法（,Chemical permeation,）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如,Triton X-100,是一种非离子型清洁剂,，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,其他的表面活性剂，如,牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠,等也可使细胞破碎。,（,1,）表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理,G-,细菌，对细胞外层膜有破坏作用。,G-,细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子,Ca,2+,或,Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦,EDTA,将,Ca,2+,或,Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（,2,）,EDTA,螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。,甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（,3,）有机溶剂,（,4,）变性剂,盐酸胍（,Guanidine hydrochloride,）和脲（,Urea,）是常用的变性剂。,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,通用性差；,时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过,50%,；,有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至,-25,形成冰晶体，利用,500MPa,以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。,此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,5.,其他方法,1. X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.,渗透压法（,Osmotic pressure,）,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,3.,反复冻结,-,融化法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在,25-30,的气流中吹干；,真空干燥多用于细菌。,4.,干燥法,气流干燥,真空干燥,喷雾干燥,冷冻干燥,三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,1.,破碎率的测定,直接测定法,目的产物测定法,导电率测定法,采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。,如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；,采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与,100%,破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,细胞破碎与固液分离紧密相关。,2.,破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合,与上游过程相结合,与下游工程相结合,化学法、酶法、机械法相结合。,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，,95MPa,压力下匀浆,4,次，总破碎率接近,100%,。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有,32%,。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如,pH,、,温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。,此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；,选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；,在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,定义：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。,原则：酶提取时首先应根据,酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂,。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。,第三节 酶的提取,酶都能溶解于水，通常可,用,水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、,pH,值等提取条件。,酶的主要提取方法,提取方法,使用的溶剂或溶液,提取对象,盐溶液提取,0.02,0.5mol/L,的盐溶液,用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶,酸溶液提取,pH2,6,的水溶液,用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶,碱溶液提取,pH8,12,的水溶液,用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶,有机溶剂提取,可与水混溶的有机溶剂,用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶,本章,目录,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在,低浓度,的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为,盐溶现象,。,+,=,-,+,=,-,盐溶液提取,（盐溶,Salting-in,）,：,Ionic strength,溶,解,度,+,-,NaCl,NaCl,KCl,-,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入,盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,酸溶液提取,有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，易用酸溶液提取。,注意事项：,pH,值不能过低，以免使酶变性失活。,碱溶液提取,有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，应采用碱溶液提取。,注意事项：,pH,值不能过高，以免使酶变性失活。,有机溶液提取,有些酶与脂质物质结合牢固，或含有较多的非极性集团，可以采用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。,注意事项：,pH,值不能过低，以免使酶变性失活。,影响酶提取的主要因素,温度,在适当的范围内，提高温度可以加快酶的提取；,pH,避免在等电点；,提取液的体积,增加提取液的用量，可以提高酶的提取率；但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步分离纯化不利,第四节 酶的分离方法,1,、,沉淀分离,2,、离心分离,3,、过滤与膜分离,4,、层析分离,Go,Go,Go,Go,5,、电泳分离,Go,6,、萃取分离,Go,本章,目录,沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,一、沉淀分离,1,、定义：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,由于其,浓缩,作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。,沉淀法由于成本低、收率高,(,不会使蛋白质等大分子失活,),、浓缩倍数高可达,l0-50,倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。,2,、 沉淀的种类,盐析沉淀法,等电点沉淀法,有机溶剂沉淀,热沉淀法,复合沉淀法,选择性变性沉淀法,1,、盐析,沉淀法,（一）定义：是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。,（二）原理,1.,高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱,.,2.,中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子,.,蛋白质表面特性,蛋白质溶解：,相似者相溶,亲水性和疏水性：,有利因素：,亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的,%,等。如白蛋白,不利因素：,疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的,%,等。如纤维蛋白原。,盐析的基本原理图,三、盐析剂中性盐的选择,盐析常用的中性盐：硫酸铵最常用。,其优点是：溶解度大，,25,时饱和溶解度为,4.1mol/L,，即,767g/L; 0,时饱和溶解度为,3.9mol/L,即,676g/L,，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来；分段效果比其它盐好，不容易引起其它蛋白质变性；价廉易得。,四、盐析剂用量的确定,例：以硫酸铵盐析糖化酶,糖化酶的盐析曲线,五、分部盐析法,1.,分部盐析法,2.,盐析曲线,3.,两种酶的分离,六,.,盐析的影响因素,1.,蛋白质的种类,蛋白质的种类不同，,K,s,（盐析系数）值会有所不同；,分子量越大，沉淀所需盐的量越少；,2.,蛋白质的初始浓度,不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。,蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小。,相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低,。,3.,无机盐种类,阴离子盐析作用顺序,柠檬酸盐,PO,4,3,SO,4,2,CH,3,COO,Cl,NO,3,SCN,阳离子盐析作用顺序（一价）,NH,4,+,K,+,Na,(NH,4,),2,SO,4,4.,温度,在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。,在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。,5.pH,值,在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移,。,2,、,等电点沉淀法,等电点定义；,在等电点时溶液的性质；,3.,有机溶剂沉淀法,蛋白质和酶的水溶液，在逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂后，其溶解度可不同程度地显著降低，从溶液中沉淀出来。这种向水溶液中加入与水混溶的有机溶剂，使生物大分子溶解度降低而分组沉淀的方法，称为有机溶剂分级沉淀法。,（一）：有机溶剂沉淀法原理,1.,有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液介电常数减小，增强偶极离子之间的静电引力从而使分子集聚而沉淀。,2.,有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。,相距为,r,的两个点，电荷,q,1,和,q,2,互相作用的静电力,F,可以下式表示：,K,：由介质的特性决定，称为介电常数，在真空中定为,1,介电常数表示介质对带有相反电荷的微粒之间的静电引力与在真空中对比减弱的倍数。蛋白质和酶是极性分子，其分子间有静电引力，水也是极性分子，能减弱蛋白质等分子间的作用力，使蛋白质较易溶解，所以水是蛋白质等极性物质的较好溶剂。,在蛋白质和油等极性物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等与水溶性的有机溶剂可降低介电常数，因而降低了蛋白质和酶的溶解度而使之沉淀。,特点,有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。,注意事项：,(1),有机溶剂的选择,乙醇和丙酮是两种最常用的有机溶剂，丙酮比乙醇的介电常数小些，即丙酮的沉淀能力较强。根据一般经验，如,30,一,40,左右乙醇沉淀的物质，改用丙酮时浓度可减少,10,左右，即用,20,一,30,的丙酮。,（,2,）温度的控制,有机溶剂沉淀的操作过程宜在低温进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷到比操作温度更低，因有机溶剂与水混溶时要放热。在加入有机溶剂时搅拌要均匀适当，以避免局部浓度过高和温度过高而导致的不良影响,.,（,3,）离子强度的控制,离子强度在有机溶剂和水的混合液中是一个特别重要的因素。有时当离子强度很小时，物质不能沉淀，如补加少量电解质即可解决。一般可用醋酸铵、醋酸钠或氯化钠等以溶剂能溶解且不影响提取物的质量为原则。当盐的离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。,(4) pH,值的控制,pH,值影响蛋白质等在有机溶剂中的溶解度。蛋白质等分级沉淀更应严格控制,pH,值。有时为了防止带相反电荷的蛋白质之间的相互结合，选择,pH,值时可使大部分蛋白质带有相同的净电荷,。,(5),待分离物质的浓度控制,蛋白质等物质浓度越大，加入有机溶剂后，由于溶解降低所引起的浓度差值也越大，蛋白质等沉淀量就越多。此外蛋白质等浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。,（,6,）金属离子的影响,金属离子与蛋白质结合，其结果常使蛋白质的溶解度降低。利用金属离子与生物大分子的反应，常有助于生物大分子的分组分离。例如，有些蛋白质与锌离子等，可形成复合物，这种复合物在水和有机溶剂的混合物中的溶解度较低，易于形成结晶。,四、实例,有机溶剂沉淀法制取食品级,-,淀粉酶,工艺流程说明：,1.,发酵液预处理,2.,压滤,3.,浓缩,4.,沉淀,5.,压滤,6.,干燥,4.,热沉淀,定义,在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。,适用对象,：,热稳定性高的蛋白质,5,、复合沉淀法,在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。,二、离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。,在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的,颗粒大小、密度和特性的不同,，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。,常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在,8000 r/min,以内，相对离心力（,RCF,）在,1104 g,以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。,高速离心机,的最大转速为（,1,2.5,）,104 r/min,，相对离心力达到,1104,1105 g,，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。,超速离心机,的最大转速达,(2.5,12)104 r/min,，相对离心力可以高达,5105 g,甚至更高。超速离心主要用于,DNA,、,RNA,、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。,1,、 离心方法的选择,对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。,超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心,1,、 差速离心,采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒,分批分离,的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。,2,密度梯度离心,样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。,密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。,常用介质：蔗糖、甘油等。,样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。,3,等密度离心,当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置（等密度点），形成区带。,等密度离心常用的介质：铯盐，如,CsCl,，,Cs,2,SO,4,，,CsBr,三、过滤与膜分离,过滤是借助于,过滤介质,将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程,。,过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。,过滤,非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质,膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质,过滤的分类及其特性,(,根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,),类别,截留颗粒大小,截留的主要物质,过滤介质,粗滤, 2m,酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等,滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等,微滤,0.2,2m,细菌、灰尘等,微滤膜、微孔陶瓷,超滤,20,0.2m,病毒、生物大分子等,超滤膜,反渗透, 20,生物小分子、盐、离子,反渗透膜,借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由,丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜,。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。,膜分离,加压膜分离,微滤,超滤,反渗透,电场膜分离,电渗析,离子交换膜电渗析,扩散膜分离,透析,四、层析分离,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是,利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的,(,称为固定相,),，另一个相则流过此固定相,(,称为流动相,),并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,。,层析分离方法,层析方法,分离依据,吸附层析,利用吸附剂对不同物质的,吸附力,不同而使混合物中各组分分离,分配层析,利用各组分在两相中的,分配系数,不同，而使各组分分离,离子交换层析,利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的,亲和力,不同而达到分离目的,凝胶层析,以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的,相对分子质量,不同而达到物质分离,亲和层析,利用生物分子与配基之间所具有的,专一而又可逆的亲和力,，使生物分子分离纯化,层析聚焦,将酶等两性物质的,等电点特性,与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离,吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。,吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成,吸附层析柱,。,层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。,在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。,分配层析,分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。,分配系数,是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。,在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为,固定相,，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为,流动相,。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。,纸上层析,分配薄层层析,分配气相层析,离子交换层析是利用离子交换剂上的,可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离,目的的一种层析分离方法。,离子交换剂,是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。,按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为,阳离子交换剂,和,阴离子交换剂,。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。,凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。,凝胶层析柱中装有,多孔凝胶,，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使,小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的,。,常用的凝胶：,葡聚糖凝胶,琼脂凝胶与琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。,酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶,RNA,与互补的,RNA,分子或片段,RNA,与互补的,DNA,分子或片段,等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用,.,载体的选择,选择适当的载体是亲和色谱能否成功的第一步，因此载体是负载着配基的固相支持物，它直接影响生物分子间的相互作用，理想的载体应具备：,1,均一，有一定硬度，不溶于水；,2,多孔网状结构，易为大分子渗透；,3,具有相当数量可供偶联反应的基团；,4,没有吸附能力，不会发生非专一吸附；,5,有足够的化学稳定性，经得起吸附洗脱和再生时所用的各种条件的处理；,6,不受微生物腐蚀和降解；,7,亲水。,（,1,）、琼脂糖凝胶,琼脂糖是,D-,半乳糖和,3,，,6-,脱水,-L-,半乳糖交替结合的链状多糖。,由于琼脂糖凝胶是一种热可逆凝胶，凝胶受热即失去稳定性，最后溶解。因此，凝胶必须保存在低温下，但不能冻结，因为冻结也破坏可逆结构。凝胶不能加热消毒，宜湿态储存。,琼脂糖耐受的溶剂和介质的条件,（,2,）、聚丙烯酰胺凝胶,能经受有机溶剂及盐类、去污剂、盐酸胍、尿素的稀溶液处理，凝胶表面有许多酰胺基可供偶联配基，它的缺点是结构紧密、孔小、有些配基在孔内，大分子钻不进小孔，因而只能接触到分布在凝胶表面上的配基，影响分离效果。,（,3,）、葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶是由葡聚糖经环氧氯丙烷交联而成的产物，它有良好的化学及物理稳定性，但多孔性则较琼脂糖凝胶为低，并且经过偶联配基的操作后，凝胶的膨胀度将进一步缩减，因而在亲和色谱中的应用也受到一定限制。,配体的选择,配体是亲和层析最重要成分。选择好的配体有三个标准：一是能和欲分离蛋白质专一性结合，而且亲和力越大越好；二是结合后又能解离，而且无损于蛋白质的生物活性；三是配体上必须含有适当的化学基团，通过这些基团可以用化学方法把配体偶联到载体上，而且这种偶联不损害配体与蛋白质的专一性结合。,亲和层析的配体大体分三类：,一是对特定蛋白质有亲和力的小分子配体，如酶底物,(,或底物类似物,),、调节配体、效应物酶捕助因子等；,二是对特定蛋白质有亲和力的大分子；,三是共价亲和层析中的配体，它含有能与目的蛋白质共价可逆作用的部分。,根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：,共价亲和层析,疏水层析,金属离子亲和层析,免疫亲和层析,染料亲和层析,凝集素亲和层析,5,、电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。,电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：,纸电泳,薄层电泳,薄膜电泳,凝胶电泳,自由电泳,等电聚焦电泳,颗粒在电场中的移动速度主要决定于其,本身所带的净电荷量,，同时受,颗粒形状,和,颗粒大小,的影响。此外，还受到,电场强度,、,溶液,pH,值,、,离子强度,及,支持体的特性,等外界条件的影响。,6,、萃取分离,萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。,按照两相的组成不同，萃取可以分为：,有机溶剂萃取,双水相萃取,超临界萃取,反胶束萃取,双水相体系萃取法,双水相的形成,将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。双水相体系的形成主要是由于聚合物的空间位阻作用，相互间无法渗透而具有强烈的相分离倾向，在一定条件下即可分为两相。聚合物水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要推动力,。,一个含有高水溶性的多聚物,(,如聚乙二醇,),溶液与另一个高水溶性多聚物,(,如葡聚糖,),的溶液混合，就可以得到依赖于多聚物浓度的两相系统。,水相系统同样可以用一种多聚物和一种盐,(,如磷酸钾,),来组成,。,各种双水相系统,聚合物,P,聚合物,Q,或盐,聚丙二醇,甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖,聚乙二醇,聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖,甲基纤维素,羟甲基葡聚糖，葡聚糖,乙基羟乙基纤维素,葡聚糖,羟丙基葡聚糖,葡聚糖,聚蔗糖,葡聚糖,聚乙二醇,硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠,双水相萃取技术的优点,1,所需设备简单，仅需一个可使粗提液与两相系统充分混合及放置的贮罐和一个离心力不高的普通离心机或使两相迅速分离的分离器。,2,操作方便、快速、条件温和。,3.,选择使用任何类型的相系统，都不要求特殊处理就可与后续提纯步骤相衔接。,层析纯化提取蛋白质的过程图解,应用液,液双相抽提技术由各种粗提取物中抽提酶,3.5,酶的组合分离纯化策略,Resolution,（,分辨率）,Speed,（,速度）,Capacity,（,容量）,Recovery,（回收率）,设计分离纯化工艺的基本要求,本章,目录,3.6,酶的浓缩、干燥与结晶,浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。,离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。,蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用,真空浓缩,。即在一定的真空条件下，使酶液在,60,以下进行浓缩。,在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：,真空干燥,冷冻干燥,喷雾干燥,气流干燥,吸附干燥,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。,酶在结晶之前，,酶液必须经过纯化达到一定的纯度,。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在,50%,以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。,要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。,有些酶在纯度达到,50%,时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。,盐析结晶,有机溶剂结晶,透析平衡结晶,等电点结晶,本章,目录,