《疫分析法》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 免疫分析法,一 免疫分析法：是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析方法。高选择性和低检出限。,分析方法：放射性免疫、荧光免疫、酶联免疫、发光免疫、电化学免疫，克隆酶给予体免疫，免疫抗散等。,抗原的概念,抗原（,antigen,Ag),：,是,一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞,),在体内外发生特异性结合的物质。,抗原的两种特性：免疫原性和抗原性（免疫反应性）,免疫原性（,immunogenicity,),能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。,免疫反应性,能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。,凡具有免疫原性和抗原性的物质称为,完全抗原,。只有抗原性而不具有免疫原性的物质称为,半抗原,。,半抗原,+,蛋白质,完全抗原,赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为,载体。,1.抗原的免疫原性,抗原物质必须具备的条件：,一、异物性,二、一定的理化性状,三、完整性,四、宿主的遗传性,一、异物性,异物,是指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类：,1、,异种物质,如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。,2、,同种异体物质,如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。,3、,自身抗原物质,如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。,二、一定的理化性状,大分子胶体物质,凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。,一定的化学组成和结构,从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。,分子构象与易接近性,分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。,三、完整性,具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。,自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白,四、宿主遗传性,抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为,免疫应答基因（,immune response,Ir),2.抗原的特异性,抗原决定簇（基）,载体决定簇和半抗原决定簇,共同抗原和交叉反应,一、抗原决定簇,1、,概念,抗原决定簇（,antigenic determinant,AD),是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为,表位,（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过,AD,与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。,2、,种类和数量,一个抗原分子可以有一种或多种不同的,AD,，一种,AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性,3、,部位,位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称,功能性决定簇，,存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。,4、大小,抗原决定簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。,一个蛋白质抗原决定簇含5-7个氨基酸残基,一个多糖抗原决定簇含5-7个单糖,一个核酸半抗原决定簇含6-8个核苷酸,5、抗原结合价,（antigenic valence)是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。,半抗原为一价,天然抗原的分子结构复杂，分子表面有多个决定簇为多价,构象决定簇,：,序列上不相连而依赖于蛋白,质或多糖的空间构象形成的决定簇，多暴,露于抗原分子表面。,顺序决定簇,：,一段相连的氨基酸序列所形,成的决定簇，多位于抗原分子内部。,功能性AD：,分子表面，易被识别,隐蔽性AD.,分子内部,B细胞决定簇：,分子表面,T细胞决定簇：,分子内部,AD的分类：,三、共同抗原和交叉反应,两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为,共同抗原。,亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为,类属抗原。,无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为,异嗜性抗原。,一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为,交叉反应。,3.抗原的分类,根据抗原的性质分类：,完全抗原,半抗原,根据抗原与机体的亲缘关系分类：,异种抗原,同种异体抗原,自身抗原,异嗜性抗原,根据抗原刺激,B,细胞产生抗体是否需要,T,细胞 的辅助分类：,胸腺依赖性抗原,胸腺非依赖性抗原,超抗原,根据抗原颗粒大小和溶解性分类,：,颗粒性抗原和可溶性抗原。,根据抗原的来源,：,外源性抗原（天然抗原和人工抗原），,内源性抗原。,胸腺依赖性抗原（,thymus-dependent antigen,TD-Ag,):,这类抗原须在抗原提呈细胞及,T,H,细胞的参与下才能激活,B,细胞产生抗体。绝大多数蛋白质抗原属于,TD-Ag,。,胸腺非依赖性抗原（,thymus-independent antigen,TI-Ag):,这类抗原刺激,B,细胞产生抗体时不须,T,细胞辅助。少数的多糖抗原属于,TI-Ag,。,表3 TD-Ag和TI-Ag的比较,特性,TD-Ag,TI-Ag,化学特性,蛋白质,多糖,结构特点,结构复杂,具有多种不同决定簇，既有半抗原决定簇又有载体决定簇,结构简单,具有重复出现的同一种抗原决定簇，无载体决定簇,巨噬细胞参与,需要,多数不需要,T细胞依赖性,是,否,应答类型,体液免疫和细胞免疫,体液免疫,诱导的Ig类型,各类Ig,IgM,免疫记忆,形成,不形成,常见的抗原种类,牛血清蛋白、卵白蛋白、类毒素,肺炎球菌荚膜多糖、脂多糖、聚合鞭毛素,超抗原（,Superantigen,SAg),：,概念：,超抗原由,White,等于,1989,年提出的，是一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的，能与多数,T,细胞结合并使其活化，极低浓度就能诱发最大的应答效应，类似丝裂原的作用。由于这类物质具有强大的刺激,T,细胞活化的能力，故称为超抗原。,超抗原的种类,：,外源性超抗原（某些细菌的外毒素）金葡菌肠毒素,A,、,B,、,C,、,D,、,E,（,staphylocccus enterotoxin,SE),葡萄球菌毒素休克综合征毒素,1,，,TSST-1,链球菌致热外毒素,A C,和,M,蛋白,关节炎支原体丝裂原（,MAM),内源性超抗原（逆转录病毒蛋白）,小鼠内源性超抗原：小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白，又叫小鼠次要淋巴细胞刺激抗原,人内源性超抗原：人类免疫缺陷病毒蛋白,超抗原的特征：,强大的刺激能力，较低浓度的超抗原（,10,-12,克分子）就能使大量的,T,细胞活化，占,T,细胞库中的,5%-20%,。,不须抗原提呈细胞的处理，超抗原的一端和,APC,表面的,MHC-,分子结合，另一端可直接与,TCR,链,V,区结合两端均为抗原结合沟槽的外侧，从而产生激活信号，使,T,细胞活化。,以完整的蛋白质分子递给,T,细胞。,与,T,细胞相互作用无,MHC,限制性，超抗原需要通过,MHC-,类分子呈递给,T,细胞，但,T,细胞的识别不受,MHC,限制性。,选择性结合,TCR,链,V,区,抗体（antibody，Ab）,：,是由抗原进入机体刺激B细胞分化增殖为浆细胞而合成并分泌的一类能与相应抗原发生特异性结合并产生免疫效应的含有糖基的球蛋白。抗体分布于体液（血液、淋巴液、组织液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清内。,1.抗体（antibody,Ab）功能性概念,是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。,2.,免疫球蛋白（,immunoglobulin,Ig,）结构性概念,具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗体。,二、,抗体的生物学活性,（,一）特异性结合抗原,超变区表位,静电力、氢键、范德华力,可逆,影响因素：PH、温度、电解质,中和效应 中和毒素和病毒,与,Ag,结合 促吞噬细胞吞噬,1.结合基础,2.实际意义,（二）,激活补体系统,Ab（,IgM,、,IgG）+Ag,C1q,补体经典途径,IgG4,、,IgA,和,IgE,的凝聚物,补体旁路途径,（三）结合Fc受体,(1),介导超敏反应：,型超敏反应；,(2),调理作用（,opsonization,）：,IgG,+抗原(颗粒性),Fc,R,（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）,促,吞噬细胞吞噬；,(3),ADCC,：,IgG,+抗原(靶细胞),Fc,R（NK,细胞）,杀伤,靶细胞。,（四）通过胎盘和粘膜,2.生物学活性,(1)通过胎盘（新生儿抗感染）；,(2)激活补体（裂解细胞）；,(3)调理作用（促进吞噬）；,(4)介导,ADCC,（细胞毒作用）。,3.实际意义,(1)抗感染；,(2)自身抗体,自身免疫病；,(3)介导变态反应(、型)；,(4)封闭抗体,肿瘤细胞逃逸；,(5)亲合层析法,IgG,纯化；,(6)免疫学检测。,抗体分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。,轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。,5.单克隆抗体和基因工程抗体,一、多克隆抗体（,polyclonal antibody,）,1.定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody,PcAb）。,2.实际意义,（1）预防、治疗感染性疾病（特异性差，可发生超,敏反应）,（2）临床诊断,二、单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,1.,定义：,由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别,抗原分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的,抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全,相同，具有高度均一性。,2,.,特点 具有高度均一性。,3,.,杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞 无限增殖；,免疫B细胞 合成、分泌特异性抗体。,4,.,杂交瘤技术,HAT,培养基：次黄嘌(,H,)、氨基蝶呤(,A,)和胸腺,嘧啶核苷(,T,)。,三、基因工程抗体,基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。,人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）；,人改型抗体（reshaped humanized antibody）；,小分子抗体；,双特异性抗体（bispecific antibody）等。,、,IgM IgG IgA IgD IgE,抗体的功能：,清除侵入机体的微生物，寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原。,抗体的规律：,初次反应，再次反应和回忆反应产生抗体。,抗体的分类：,