《细胞转染技术》PPT课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞转染技术,一：转染的简介,二：转染的分类,三：转染的方法,一、转染的简介,1.,基因转染,:,将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。,2.,基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。,二 、转染的分类,瞬时转染,稳定转染,目的,快速分析,为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆,目的,DNA,与宿主染色体,未整合,整合,表达持续时间,随细胞分裂而稀释至丢失,48,72,小时,随宿主细胞本身基因组一样复制，转录，翻译，并被稳定遗传,筛选办法,抗生素抗性,抗生素抗性,基因转染真核细胞的方法,转染方 法,化学,转染法,物理,转染法,病毒,感染法,DEAE,一,葡聚糖法,显微,注射法,逆转录病毒,磷酸钙法,电穿孔法,腺病毒,人工,脂质体法,基因枪法,是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。,DEAE-,葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。,DEAE,一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。,DEAE-,葡聚糖法,磷酸钙共沉淀转染法,由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将,DNA,和氯化钙混合，然后加人到,PBS,中慢慢形成,DNA,磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人,DNA,。,脂质体介导法（目前应用最广泛）,原理：阳离子脂质体试剂与,DNA,混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，,DNA,被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，,DNA,被释放到胞浆中。,此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。,【,主要应用,】:,瞬时转染 稳定转染,.,【,特点,】,：使用方法简单，可携带大片段,DNA,，通用于各种类型的裸露,DNA,或,RNA,，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。,利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。,物理方法,(,电穿孔、显微注射及基因枪,),（,1,）电穿孔法,利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。,(2,）显微注射法,该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。,（,3,）基因枪法,该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。,实验室用到的转染方法,脂质体介导法,细胞转染,Lipofectamine 2000,转染试剂：以,HEK193,细胞为例：,转染前一天，将细胞铺到培养皿中，,加入有血清无双抗的培养基（,15ml,）；,24,小时候换上无血清无双抗的培养基,12ml,；,将所需的质粒用,1.5ml,无血清无双抗的培养基稀释；取,40ul,的,Lipofectamine 2000,加入无血清无双抗的培养基稀释，室温放置,5min,；,5min,后将质粒和,Lipofectamine 2000,混合在一起，室温放置,20min,后加入培养皿中，,4h,后换上完全培养基,48h,培养；,注：,24h,看一次，如果培养基变颜色换培养基；,转染的影响因素,细胞,（,1,）分裂细胞相比较非分裂细胞,（,2,）贴壁细胞相比较悬浮细胞,（,3,）传代次数,（,4,）细胞数量（融合率）,2,交叉污染,如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被,HeLa,细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。,3,载体,DNA,对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。,（,1,）载体完整性,（,2,）载体制备物,4,组织培养试剂,一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。,(1),基础培养基,(2),胎牛血清,(3),添加剂,