植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物总,DNA,的提取及琼脂糖凝胶电泳检测,植物基因组,DNA,的提取,琼脂糖凝胶电泳检测,脱氧核糖核酸,(DNA),、核糖核酸,(RNA),与蛋白质结合在一起以核蛋白（,DNP,）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。,植物总,DNA,包括细胞核,DNA,和细胞核外,DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体,DNA(mtDNA,),和叶绿体,DNA(ctDNA,),。,背景知识,核酸的存在形式,DNA,为白色类似石棉样的,纤维状物,，,RNA,的纯品呈,白色粉末或结晶,。,DNA、RNA,和核苷酸都是,极性化合物,，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。,在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,核酸的理化性质,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,机械方法：,超声波处理法、研磨法、匀浆法；,化学试剂法：,用,SDS,处理细胞；,酶解法：,加入溶菌酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,SDS,法,SDS,是有效的阴离子去垢剂,细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS,能够破坏这种价键。,CTAB,法,CTAB,是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的,DNA-,蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使,DNA,与蛋白质分离。,DNA,提取,蛋白质,常用苯酚：氯仿：异戊醇（,25,：,24,：,1,）或氯仿：异戊醇（,24,：,1,）抽提。,RNA,常选用,RNase,消化，或是用,LiCl,来消除大分子的,RNA,。,酚类物质,提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。,多糖,提取液中加,1,PVP,。,DNA,纯化（去杂质）,实验材料,新鲜蔬菜叶片,(,去叶脉,),试剂,2,CTAB,抽提液,TE,缓冲液,(pH=8.0),氯仿：异戊醇,(24:1),材料与试剂,离心机,水浴锅,研钵,微量移液器,仪器用具,移液器量程的选择,1,取,2g,清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加,1/3,药匙石英砂和,4mL 2,倍的,CTAB,提取液，迅速研磨。,2,将,1mL,研磨液转入,1.5mL,离心管中，置于,65,水浴中保温,20min,，其间颠倒混匀,2,3,次。,破碎细胞,3.12000r/min,离心,5min,，取上清液,700,L,转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（,24:1,）混合液，充分颠倒混匀。,12000r/min,，离心,5min,。,抽提去蛋白,4,将上清液移入新的,1.5mL,离心管内，加,600L,异丙醇。颠倒混匀，可见,DNA,絮状沉淀。,沉淀核酸,5,12000r/min,，离心,1min,，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。,将沉淀回溶于,20L TE,缓冲液待测。,操作步骤,1),选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与,CTAB,抽提液充分混匀；,2),若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（,2,5,），尽可能选取幼嫩的材料；,3,）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,注意事项,DNA,分子在高于等电点的,PH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,电泳原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖浓度,(%),线型,DNA,分子的分离范围,(Kb),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.9,6,1.5,0.2,3,12.0,0.1,2,仪器和试剂,仪器,电泳仪,电泳槽,灌胶模具等,Tris,-,硼酸（,TBE,）,Tris,-,乙酸（,TAE,）,Tris,-,磷酸（,TPE,）,常用电泳缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖,400,组成上样缓冲液。,作用：,增加样品比重，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内。,形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。,使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭（,EB,）,是一种荧光染料，,EB,分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与,DNA,的含量成正比。据此可粗略估计样品,DNA,浓度。,琼脂糖凝胶,EB,染色，肉眼可见核酸电泳带，其,DNA,量一般,5ng,。,核酸染色剂,注意事项：,EB,是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA,分子量标准,不同种类,DNA Marker,1.,凝胶制备,制备,0.8%,琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入,20mL 0.5,TBE,，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至,50-60,时，加入,EB,至终浓度,0.5,g/mL,。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。,2.,加样,取,10,l DNA,样液与,2,l,上样,buffer,混匀，用微量移液器小心加入样品槽。,3.,电泳,接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为,15V/cm,（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。,4.,观察拍照,四、操作步骤,1.,结合原理，简述,CTAB,法分离提取植物总,DNA,的基本过程。,2.,为了获得高质量的植物总,DNA,，在分离提取过程中应注意那些问题？,What,?!,How?!,思考,