免疫荧光总结课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫荧光技术,陈海蓉,一、一些基本概念和基本知识：,1,荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，,测定复合物中的荧光素,，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术,2.,技术分类：,荧光抗体技术,(,荧光显微镜技术,),抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判,定结果的检测方法,免疫荧光测定技术：,抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定,荧光强度而推算被测物浓度的检测方法,荧光的产生：,物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质称为荧光素,由光激发所引起的荧光，为光致荧光,-荧光免疫技术,由化学反应所引起的荧光，为化学荧光,-化学发光技术,荧光素的荧光特性：,停止供能，荧光现象随即终止,对光的吸收和荧光的发射具高度选择性,入射光波长发射光波长,荧光效率： 发射荧光的光量子数,荧光效率,=,吸收光的光量子数,荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱,5,常见荧光素：,FITC, RB200, TRITC,镧系：,Eu,、Tb, PE,其它,常见荧光素的特性：,FITC：,黄色结晶粉末，吸收光：490495,nm，,发射光：520530,nm，,明亮的黄绿色荧光,RB200：,橘红色粉末, 吸收光570,nm，,发射光,595600,nm，,橘红色荧光,TRITC：,紫红色粉末，吸收550,nm，,发射光,620,nm，,橙红色荧光,镧系：,Eu,、Tb, PE：,吸收光490560,nm，,发射光595,nm，,红色,荧光, 其它：酶作用后产生荧光物质,合适荧光素的选择,具有与蛋白质形成共价键的化学基团,荧光素,-,N=C +NH-,蛋白质 荧光素,-,N-C-N-,蛋白质, ,S H H S H,荧光效率高，标记后下降不明显,荧光色泽与背景色泽对比鲜明,标记后能保持生物学活性和免疫活性,标记方法简单、快速,安全无毒,7,标本的固定：,固定目的,防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落,去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质,易于保存,常用的固定方法：,抗原 固定剂 固定方法,蛋白质,95%,乙醇 室温,310,min,或430,min,Ig,类 甲醇 同上,酶类 丙酮 同上,激素,CCl,4,同上,类脂质,10%,福尔马林 室温,310,min,多糖,(,细菌,) 10%,福尔马林 室温,310,min,或430,min,丙酮、甲醇,病毒 无水乙醇 室温,510,min,或43060,min,丙酮,、,CCl,4,或-20 60,min,以上,二、试验类型,1,直接法,2,间接法,3,补体结合法,4 双标记法,抗原,标记抗体,光源,荧光,直接法原理示意图,间接法原理示意图,抗原,抗体,标记抗体,光源,荧光,三、 方法,在35,mm,培养皿中接种细胞，至生长旺盛时，用甲醇直接固定5,min,加1,ml PBST,振荡洗涤3次，每次5,min,用1：100浓缩正常羊血清（2,000 ,g，,离心5,min）,封闭非特异性位点30,min,加1,ml PBST,振荡洗涤3次，每次5,min,三、 方法,5. 滴加1：500 第一抗体510,-4,L（JWA,多克隆抗体和单克隆抗体，2,000 ,g ，,离心5,min）， 37,于摇床湿盒中，孵育2,h,6. 加1,ml PBST,振荡洗涤3次，每次5,min,滴加1：300 第二抗体510,-4,L（FITC,标记羊抗兔,IgG,和罗丹明标记的,IgG (H+L)，2,000 g，,离心5,min）， 37,于摇床湿盒中，孵育1,h,加1,ml PBST,振荡洗涤3次，每次5,min,三、 方法,9. 小心切除培养皿侧边，注意其皿底的平整性，再用,PBST,缓冲液轻轻冲洗一下以确信洗去滞留在细胞面上的微小塑料屑，并于通风处晾干,10. 滴加阻止荧光淬灭剂,Vectashield,滴，并覆以酒精擦净晾干的盖玻片，遮光低温4保存,11.,于,IX-70,倒置荧光显微镜（奥林巴斯，日本）下用1,000油镜观察，同时也可应用激光共聚焦显微镜进行观察并照相,四、 注意事项,1.,标本的固定原则是：不能损伤细胞内的抗原；不能凝集蛋白质；不能损伤细胞形态；固定后应保持细胞膜 的通透性，以允许抗体进入与抗原结合,2.,荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定,四、 注意事项,由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观 察,保存的方法可采取以下几种：固定标本片以后低温保存，随用随染；染色片采取优质封固剂,谢谢,