《各种PCR介绍》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction),根据细胞分裂中,DNA,半保留复制,机理，在体外快速扩增某一特定,DNA,片段的方法。,PCR,工作原理,以,要扩增的,DNA,分子为,模板,，,以,一对与模板5末端和3末端互补的寡核甘酸片段为,引物,4种,脱氧核糖核甘酸,存在的条件下,依赖,DNA,聚合酶,的,酶促合成,反应,。,PCR,特异性,取决于,引物,和模板,DNA,结合特异性,。,体外,(,试管中,),扩增特异,DNA,片段,短,时,间,内即可将所需,目的,DNA,片段,扩增至100万,倍以上,PCR,技术,特点,敏感度高、特异性强、产率高、,重复性好、操作简便、快速,PCR,体系基本组成,模板,DNA：,（10,2-5,）,拷贝,dNTP,底物：,20200,umol,/L,特异性,引物：,0.10.5,umol,/L,DNA,聚合酶：,Klenow,T4、T7,聚合酶,TaqDNA,聚合酶,:,耐热,稳定性、,5-3,聚合,酶活性及3-5外切酶活性，可,校正,PCR,反应中某些单核甘酸的,错配,。,含,Mg,2+,的缓冲液：,Mg,2+,能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.0,mmol,/L，,过量将增加非特异性条带的产生。,循环次数取决于模板,DNA,的浓度30次,扩增100万倍,反应分,三步,：,1,变性,denaturation,：,加热,90-95,，模板,DNA,双链解离形成,单链,DNA,；,2,退火,annealling,：,温度突然降低,引物与模板,DNA,结合,40-60,Tm,值,4（G+C）+2（A+T）,-5.,3,延伸,extension：,TaqDNA,聚合酶,以4,dNTP,为底物，在,Mg,2+,存在 的条件下，,催化,DNA,合成,。,70-75,时间-要扩增片段长度决定,待扩增片段：1000,bp,引物,Tm,55,DNA,模板变性:,94,5,分钟,;,PCR,循环,(30,次,):94,30,秒,;,50,45,秒,;,72,1,分钟,;,最终延伸,:72,10,分钟,PCR,反应条件的设定,PCR,产物的检测,琼脂糖凝胶电泳；,分子杂交；,限制性内切酶酶切分析；,微孔板夹心杂交法；,直接测序,PCR,产物的检测,-,琼脂糖凝胶电泳,PCR,产物,PCR,产物,PCR,技术的应用,1,.基础研究,(1)基因或,cDNA,克隆,：从基因数据库中获得某一基因或,cDNA,的核,苷酸序列，用,PCR,方法扩增并克隆该基因或,cDNA,。,(2)基因表达：,用,RT-PCR,检测某一特定基因在转录水平的表达,。,2.医学,(1),感染性疾病,病原体的诊断：,HIV,、,结核分枝杆菌、乙肝病毒等。,(2),遗传病相关基因,的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。,(3)恶性肿瘤的诊断,3.基因动、植物的检测,(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。,(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。,PCR,新技术,RT-PCR：,用于,RNA,分析,梯度,PCR,：可用于找出最适合的退火温度,反向,PCR,：,可对未知序列扩增后进行分析,不对称,PCR,：,用于制备单链,DNA,多重,PCR,：,加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段,降落,PCR,：用于,PCR,条件的优化，,避免非特异性序列的扩增,实时定量,PCR,(Real Time Quantitative PCR,qRT,-PCR),巢式,PCR,：,使用两对（而非一对）,PCR,引物扩增完整的片段,反转录,PCR(,RT-PCR,),RT-PCR,将以,RNA,为模板的,cDNA,合成,同,PCR,结合,在一起，提供了一种,分析基因表达,的快速灵敏的方法。,5,3,AAAAA,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,RT-PCR,原理,mRNA,1,st,cDNA,逆转录酶、,下游引物、,dNTPs,Taq,DNA,聚合酶,、,上游及下游引物、,dNTPs,5,5,3,3,特异,PCR,产物,5,5,3,3,经,30,个循环，产生,2,30,个分子拷贝,5,5,3,3,一步法,RT-PCR,RT,反应与,PCR,反应在同一个试管中进行。,两步法,RT-PCR,RT,反应与,PCR,反应在不同的试管中进行。,下游引物,特异性引物,Oligo(dT,),降落,PCR,（,Touchdown PCR,）,用来避免非特异性序列的扩增,PCR,中引物的黏合温度,(annealing temperature),决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行,PCR,时需要,寻找合适的黏合温度,。,降落,PCR,开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降,1,，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。,反向,PCR,(Inverse PCR,IPCR),扩增引物相反方向,DNA,序列的技术,。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规,PCR,扩增的是已知序列的两引物之间,DNA,片段,.,实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段,DNA,进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行,PCR,，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究,.,利用反向,PCR,可,对未知序列扩增后进行分析,，探索邻接已知,DNA,片段的序列，并可将仅知部分序列的全长,cDNA,进行分子克隆，建立全长的,DNA,探针。,1.,用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶 消化大分子量的,DNA2.,产生的大小不同的线性,DNA,片段群体，其中具靶,DNA,区段的,DNA,分子长度不超过,2-3Kb,经连接后环化成环状分子,3.,按靶序列设计的一对向外引物同靶序列,5,，,-,端互补序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指,4.,经,PCR,扩增产生的主要是线性双链,DNA,分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制酶的识别位点,不对称,PCR,（,asymmetric PCR,）：,用于制备单链,DNA,PCR,扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的,1%,（或,2%,）。经过,PCR,循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的,DNA,序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的,DNA,链做模板，继续引导,DNA,合成。,这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的,DNA,要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。,多重,PCR,一般,PCR,仅应用一对引物，通过,PCR,扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定,.,多重,PCR(multiplex PCR),，又称多重引物,PCR,或复合,PCR,，它是在同一,PCR,反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的,PCR,反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般,PCR,相同。,多重,PCR,的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。,梯度,PCR,（,Gradient PCR,）,是指我们在摸,PCR,条件的时候采取的一种手段，因为不能确认引物的最佳退火温度，会采用梯度,PCR,，同时在不改变其他,PCR,条件的情况下，对目的基因使用不同的退火温度，最终找到一个适合目的基因的退火温度。在这里，每个,PCR,反应管只有一个退火温度。,实时,荧光,定量,PCR,技术,实现了,PCR,从,定性,到,定量,的飞跃,实时荧光定量,PCR,原理,指在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用,荧光信号积累,实时监测整个,PCR,进程，,最后通过标准曲线,对未知模板进行定量,分析的方法。,特异性更强、有效解决,PCR,污染、,自动化程度高、实时监测,反应过程,Ct,值的定义,在荧光定量,PCR,技术中重要概念,Ct,值,C,代表,Cycle，t,代表,threshold，,Ct,值：,每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数,Ct,值与起始模板的关系,每个模板,Ct,值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，,起始拷贝数越多，,Ct,值越小,。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，,横坐标,起始拷贝数的对数，,纵坐标,代,Ct,值。只要获得未知样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。,巢式,PCR,（,Nested PCR,）,巢式,PCR,是一种变异的聚合酶链反应,(PCR),，使用,两对（而非一对）,PCR,引物扩增完整的片段,。第一对,PCR,引物扩增片段和普通,PCR,相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次,PCR,扩增片段的内部）结合在第一次,PCR,产物内部，使得第二次,PCR,扩增片断短于第一次扩增。巢式,PCR,的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式,PCR,的扩增非常特异。,巢式,PCR,，可以在,10,6,基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的,PCR,。,谢谢,