时间分辨荧光免疫分析课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/1/12,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,时间分辨荧光免疫分析,时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析开展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-二酮体-EDTA,1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A,“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获2003年度国家科技进步二等奖22021/1/12,时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析,开展历程,1979年，可标记抗体的Eu3+-二酮体-EDTA,1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A,“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获2003年度国家科技进步二等奖,2021/1/12,2,开展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-二酮体-EDT,一、时间分辨荧光免疫分析特点,2021/1/12,3,一、时间分辨荧光免疫分析特点2021/1/123,1.,荧光衰减时间长,镧系元素荧光衰变时间,2021/1/12,4,1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间2021/1/124,常见荧光物质荧光寿命,荧光物质,荧光寿命,Eu,3+,714,s,非特异性荧光背景,1-10 ns,人血清白蛋白,4.1 ns,人球蛋白、血红蛋白,3.0 ns,细胞色素,C,3.5 ns,FITC,4.5 ns,丹磺酰氯,14 ns,苯胺萘磺酸,16 ns,稀土螯合物,10,4,-10,6,ns,2021/1/12,5,常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714 s非特,2. Stokes,位移大,荧光物质,激发波长,发射波长,Stokes,位移,Eu-(,-NTA),3,340 nm,613 nm,273 nm,Sm-(,-NTA),3,340 nm,600 nm,260 nm,Tb-(PTA),3,295 nm,490/543 nm,195/248 nm,Dy-(PTA),3,295 nm,573 nm,278 nm,2021/1/12,6,2. Stokes位移大 荧光物质激发波长发射波长Stoke,镧系元素发射峰窄,2021/1/12,7,镧系元素发射峰窄2021/1/127,优点,灵敏度高10-18mol/孔,原子标记,多标记技术,2021/1/12,8,优点2021/1/128,二、时间分辨荧光免疫分析体系,非均相时间分辨荧光免疫分析,均相时间分辨荧光免疫分析,2021/1/12,9,二、时间分辨荧光免疫分析体系2021/1/129,一非均相时间分辨荧光免疫分析,时间分辨固相免疫分析,解离增强荧光免疫分析,酶放大免疫分析,2021/1/12,10,一非均相时间分辨荧光免疫分析2021/1/1210,1.,时间分辨固相免疫分析,灵敏度一般不高,2021/1/12,11,1.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高2021/1/1211,实例,加拿大,Cyber Fluor,的,FIAgen,系统,Eu,3+,-BCPDA,为标记物,2021/1/12,12,实例2021/1/1212,2.,解离增强分析,原理示意图,2021/1/12,13,2.解离增强分析原理示意图2021/1/1213,1双功能螯合剂,EDTA,衍生物、,DTTA,衍生物、,DTPA,衍生物,一端与镧系离子螯合，一端与抗原,/,抗体连接,近中性时，螯合物足够稳定,酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放,Eu-DTTA,应用最广泛,2021/1/12,14,1双功能螯合剂EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍,2增强液,增强原理图,一般增强百万倍,2021/1/12,15,2增强液增强原理图2021/1/1215,-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物,TOPO：荧光增强协同剂,Triton X-100：外表活性剂，形成胶束,醋酸：酸性介质,2021/1/12,16,-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物2021,3酶放大,酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物,ALP,2021/1/12,17,3酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生,酶放大免疫分析示意图,2021/1/12,18,酶放大免疫分析示意图2021/1/1218,双标记测定,AFP,和,-hCG,-NTA,作为螯合剂,340 nm,激发，,Eu:615 nm, 820,s,；,Sm:643 nm, 88,s,2021/1/12,19,双标记测定AFP和-hCG-NTA作为螯合剂2021/1,二均相免疫分析,基于时间分辨荧光共振能量转移,无需洗涤、别离、加增强液,2021/1/12,20,二均相免疫分析2021/1/1220,TBP-Eu,：,Eu,3+,-,二吡啶二胺，最大发射,615nm,，供体,APC,：别藻蓝蛋白，最大发射,665nm,，受体,能量转移效率最高的供体,/,受体对,2021/1/12,21,2021/1/1221,时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图,2021/1/12,22,时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图2021/1/1222,三、时间分辨免疫分析方法,夹心法,竞争法,间接法,捕获法,生物素,-,亲和素放大法,2021/1/12,23,三、时间分辨免疫分析方法夹心法2021/1/1223,1.,夹心法,双抗体夹心法,2021/1/12,24,1. 夹心法双抗体夹心法2021/1/1224,双抗原夹心法,2021/1/12,25,双抗原夹心法2021/1/1225,2.,竞争法,2021/1/12,26,2. 竞争法2021/1/1226,3.,间接法,间接法测定,HCV,抗体,2021/1/12,27,3. 间接法间接法测定HCV抗体2021/1/1227,4.,捕获法,捕获法测定抗,-CMV IgM,2021/1/12,28,4. 捕获法捕获法测定抗-CMV IgM2021/1/12,5.,生物素,-,亲和素法,生物素,-,亲和素检测,PAPP-A,2021/1/12,29,5. 生物素-亲和素法生物素-亲和素检测PAPP-A2021,四、应用,1.,肿瘤标志物检测,2.,传染病检测,3.,糖尿病检测,4.,激素检测,5.,细胞活性检测,2021/1/12,30,四、应用2021/1/1230,1.,肿瘤标志物,AFP测定：双抗体夹心法,固相包被抗体,参加样品或标准品,参加Eu标记抗体,参加增强液,测定荧光,灵敏度：0.17 U/ml,2021/1/12,31,1.肿瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法2021/1/1231,2.,传染病检测,梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法,强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照,阴性对照、阳性对照和样品参加板上，孵育,参加铕标记抗原，孵育,参加增强液，检测荧光,符合中国药品生物制品鉴定所结果,2021/1/12,32,2. 传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法2021/1,3.,糖尿病检测,C-肽检测：双抗体夹心法,抗体包被微孔板,参加标准品或样品,参加铕标记抗体,增强液，检测荧光,灵敏度：,2021/1/12,33,3.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法2021/1/1233,4.,激素检测,三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法,微孔板中参加抗体,标准品或样品、铕标记T3,参加增强液，测定荧光,灵敏度：,2021/1/12,34,4.激素检测三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法2021/1/1,5.,细胞活性检测,测定细胞活性原理图,T,：靶细胞,E,：效应细胞,2021/1/12,35,5.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞2021/1/1,NK,细胞活性,靶细胞：K562细胞,参加EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4C孵育,向靶细胞中参加效应细胞NK细胞，孵育，离心，测上清荧光,计算比释放率%,2021/1/12,36,NK细胞活性靶细胞：K562细胞2021/1/1236,谢谢,谢谢,内容总结,时间分辨荧光免疫分析。1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A。“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获2003年度国家科技进步二等奖22021/1/12。2021/1/12。常见荧光物质荧光寿命。104 -106 ns。EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物。一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接。340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 s。谢谢,内容总结时间分辨荧光免疫分析。1983年，建立时间分辨荧光免,