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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞工程,Cell Engineering,Chapter 6、细胞拆合与克隆技术,61 细胞拆合,611 细胞拆合技术发展概况,612 细胞拆合概念与意义,613 细胞拆合技术与关键,62 克隆技术,621 克隆的定义及理论基础,622 细胞核移植（也是克隆技术关键）,623 克隆动物一般制备技术,624 体细胞克隆技术,625 克隆技术的应用与意义,626 存在的问题,627 克隆技术发展趋势,61 细胞拆合,611 细胞拆合技术发展概况,612 细胞拆合概念与意义,一、细胞拆合（Cell Reconstruction）：,是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组,分，在体外一定条件下将不同细胞来源的,细胞器及其组分进行重组形成有生物活性,的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。,二、细胞拆合过程：,细胞器及其分离 同种或异种细胞器与,组分重组 新的重组细胞或新的性状或产品,细胞核分离、 细胞核,胞质体的获得 融合,胞质体,三、细胞拆合基本方式（目前）,四、细胞拆合意义,细胞拆合技术是现代生物工程中令人,瞩目的热点课题，细胞拆合与细胞融合,技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平,上主要构建手段，它与基因转移技术、,干细胞技术等结合，可以人为地获得新,物种或使细胞表达新的性状和新的产物。,613 细胞拆合技术与关键,一、细胞拆合技术方法,细胞组分分离技术,分级分离法 细胞大小、密度,密度梯度离心法 利用 细胞表面电荷,流式细胞分选仪分离法 细胞表面标志,细胞破碎方法,超声波破碎法,反复冻融法：-70 37C，重复3-4次，,细胞壁破碎,化学裂解法：SDS（十二烷基磺酸钠）,高速组织捣碎法：需循环水冷却,流式细胞分选仪,去核细胞（胞质体）的制备：（见罗立新表5-1）,核体的制备：,贴壁法纯化（见图5-2、5-3）,核体需5-10h再贴壁,培养 分离,完整细胞需2h （菲可液梯度离心）,微核体的制备：,CB具有排核作用，形成的微核体；,01ug/mL秋水仙胺，48h，处理细胞,细胞微核化 离心14000r/min、20min，,80-90% 1-3%牛血清密度梯度离心,（见图5-4）, 去核细胞的性质：,二、细胞拆合技术关键,细胞器与完整细胞融合：,ctDNA叶绿体,（抗药性、色素） 细胞器分离 细胞器包裹,mtDNA线粒体,形成脂质体或血影细胞 与完整细胞融合,生物大分子引入完整细胞：,1975年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼mRNA,鲤金鱼,金鱼受精卵,鲫金鱼,62克隆技术,621 克隆的定义及理论基础,一、克隆（clone）：,克隆原意为“扦插的枝条”无性繁殖系,基因克隆（实为基因扩增）,细胞克隆（实为有丝分裂的细胞集落）,个体克隆（如植物快繁个体）,引伸为“克隆操作技术，即核移殖技术”,二、理论基础：,体细胞具有细胞全能性,三、发展历程：,622 细胞核移植（也是克隆技术关键）,一、定义,细胞核移植技术：是指利用显微操作技术将,某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟,卵内的精细技术；,它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植；,它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生,物学等问题的研究，实现不同细胞核与细胞质的,组配，还能培育出新物种。,二、发展历程,三、核移植技术,供体和受体的准备,鱼类：,供体囊胚细胞或成体细胞，,受体成熟的卵细胞 发育,（人工催产、水中激活） 时间,两栖类： 配合,供体囊胚细胞或成体细胞， 好,受体成熟卵细胞（人工针刺）,鸟类、爬行类：未知,哺乳类：,供体早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细,胞；后用体细胞，如乳腺细胞、粘,膜上皮细胞；合子核到64细胞期，,0.2%链霉蛋白酶预处理,溶去胚胎,胶膜及透明带,分离单个卵裂球；,受体去核卵母细胞、受精卵、2细胞胚,胎（第一极体成熟时期去核）；,去卵膜和卵核用玻璃微针（尖为2-4um）,鱼卵借助第二极体标志，去核；,两栖卵紫外线去核；,哺乳卵借助第一极体；,供体细胞制备：,胚胎或组织机械切割 置细胞分离液,（含胰蛋白酶）处理几分钟 单细胞短期培养,移植,选择合适微吸管（比细胞核大，比供体细胞小,），不能多带细胞质，须30-40min内完成操作过,程，温度16-18C；,显微操纵术：原子力显微镜、显微操纵仪；,显微操作仪,核移植操作过程,623 克隆动物一般制备技术,一、胚胎细胞核移植法,世界：,1984年，英，绵羊; 2019年，日本；,2019年，澳大利亚，孪生牛; 2019年，食用牛,目前，小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、羊、猴,中国：,1990年，中国发育所，兔；西北农大，山羊;,1991年，台湾，猪 ; 1992年，江苏农科院，兔 ;,2019年，中国发育所与扬州大学，山羊;,2019年，华南师院与广西师大，克隆杂色牛;,2019年，西北农大，猪,2019年，湖南医科大，小鼠,二、胚胎干细胞核移植：,鼠，8细胞前胚胎，,细胞全能性明显,三、胎儿成纤维细胞核移植：,2019年，3只山羊,624 体细胞克隆技术,一、体细胞克隆技术：,是指将动物体细胞经过抑制培养，,使其处于休眠状态，利用细胞核移植技,术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎,后移植到受体，妊娠产仔，克隆出非成,体动物。,20世纪，50年代，体细胞克隆出成体,蛙，但哺乳类个体不成功,2019、2、23，英格兰、爱丁堡罗斯林,研究所与PPL制药公司，伊恩.维尔穆特博,士研究小组，用白绵羊细胞核+黑绵羊去,核卵母细胞，培育出克隆绵羊“多莉”，现,存活,2019、7，美国，夏威夷大学，用豚鼠细,胞核+黑鼠去核卵细胞，培育出50只克隆鼠,，克隆猪,2019、1，中国，克隆牛（卢光锈，中南,大学，干细胞，克隆人胚胎）,2019、8，经过李宁教授领导的课题组,一年多的科技攻关，8月5日，我国第一头,体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生,。该项目得到了国家重点基础研究发展规,划“973”项目以及北京市自然科学基,金资助。,2019、12，中国农业大学，高产奶牛体细胞,克隆技术的研究获得突破，利用成年母奶牛成,纤维细胞、颗粒细胞和胎儿成纤维细胞、胎儿输,卵管上皮细胞作为供体核克隆时重构胚的囊胚发,育率，分别为41%、41%46%和39%。克隆胚胎,的移植后60天妊娠检查时，妊娠率为35.2%,（51/145），妊娠母牛早期流产率为15.2%,（8/51，指妊娠159天前），早产率为4%,（2/51，指妊娠7-8个月）。,体细胞克隆高产奶牛,2019、2，美国科学杂志日宣,布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早,期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科,学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细,胞。汉城国立大学和美国密歇根州立大学等,机构的科学家参与了这项研究。名健康,妇女为这项研究志愿捐献了个卵细胞,以及被称为卵丘细胞的体细胞。,科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其,植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用,化学手段刺激卵细胞分裂，共有个克隆细胞经,过约天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被,称为胚囊的早期胚胎阶段。科学家们从这些胚囊中,分离出个内层细胞团，并在此基础上最终获得,一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法,获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细,胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。,克隆人早期胚胎(1),克隆人早期胚胎(2),2019、3，中国首批转基因体细胞克隆牛的再克隆体日前成功降生。,克隆羊借腹生子津城落地,克隆动物可以自然交配,中国转基因克隆技术再破难关,荧光小猪,625 克隆技术的应用与意义,一、无性繁殖意义为：有利于保护柔弱的,胚胎期；有利于大量快速繁殖。,二、检验动物细胞全能性（理论上）；,三、加速动物繁殖，优良育种，保护珍稀,动物；,四、用于医药领域克隆动物（器官大,小与人相当），培育组织、器官，如,用猪肝、羊颅骨、鸡肌腱、猪关节软,骨作替代器官；,626 存在的问题,一、技术尚不成熟：,克隆动物成功率低，死亡,率高；,二、克隆动物的体细胞突变、寿命和其他遗传,问题，如无遗传物质交换，适应力差，易,突变；,三、理论问题：,克隆并非完全复制，体细胞也,有变异，理论问题值得深入；,四、社会伦理问题：,从医学上讲，赞同者多；,从伦理上讲，反对者多；难判断；,627 克隆技术发展趋势,克隆技术与转基因技术、干细胞技术结合；,灵长类、鸟类、爬行类作为克隆对,象。,【思考题】,1、何谓细胞拆合技术？,2、何谓胞质体、微核和微核体？,3、克隆技术的关键和发展趋势是什么？,4、从理论上分析和建立“克隆鸡”的技术,路线。,xiexie!,谢谢！,
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