生物制药工艺学基因工程制药课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程制药,1,医学ppt,基因工程制药1医学ppt,第一节 概述,第二节 基因工程药物的生产的过程,第三节 目的基因的获得,第四节 基因表达,第五节 基因工程菌生物代谢的特点,第六节 基因工程菌的不稳定性,第七节 基因工程菌中试,第八节 重组工程菌的培养,第九节 高密度发酵,第十节 基因工程药物的分离纯化,第十一节 变性蛋白的复性,第十二节 基因工程药物的质量控制,第十三节 基因工程药物的制造实例,2,医学ppt,第一节 概述 2医学ppt,第一节 概述,基因工程,的概念,基因工程又称为重组,DNA,技术或基因克隆技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成,目的基因,，令其与载体构建成,重组,DNA,，再转移到,受体细胞,，目的基因在细胞中表达得到期望的由这个外源基因所编码的,蛋白质,获得新的遗传性状。,3,医学ppt,第一节 概述基因工程的概念 基因工程又称为重组DNA技,基因工程的诞生,打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流,，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景。,4,医学ppt,基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因,基因工程是,生物技术的核心,，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。,世界上第一个基因工程产品,人胰岛素,（美国，,1982,年）,中国第一个基因工程药物,1b,干扰素,（,1997,年）,美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。,5,医学ppt,基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治,为什么选择基因工程,传统制药,存在的问题：,A.,材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；,B.,内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不应求；,C.,由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制；,D.,提取中难免感染，后果严重。,基因工程技术,的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,6,医学ppt,为什么选择基因工程传统制药存在的问题：6医学ppt,生化提取,基因工程表达,人生长激素（侏儒症）,成本高产量低,质量难以保证,成本低产量高,活性强性质优,50,具新鲜尸体,脑下垂体中提取,基因工程,1-2,升细菌培养液,7,医学ppt,生化提取 基因工程表达人生长激素（,基因工程药物,在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防和诊断提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断试剂。,8,医学ppt,基因工程药物在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等,基因工程技术可生产的药物和制剂包括,：,免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；,细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；,激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；,酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶,。,9,医学ppt,基因工程技术可生产的药物和制剂包括：免疫性蛋白，如各种抗原和,基因工程技术生产药品的优点：,a.,可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；,b.,可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；,c.,利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；,d.,内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；,e.,利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 源。,10,医学ppt,基因工程技术生产药品的优点：10医学ppt,关于中国,20,世纪,70,主末，开始应用,DNA,重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品 改造传统制药工艺。,“,863”,高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。,我国基因工程药物主要集中在仿制上。,下游技术落后于上游技术,11,医学ppt,关于中国20世纪70主末，开始应用DNA重组技术、淋巴细胞杂,第二节 基因工程药物生 产过程,12,医学ppt,第二节 基因工程药物生 产过程12医学ppt,基因工程技术,是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌,(,或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术,13,医学ppt,基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿,基因工程药物制造的主要步骤,目的基因的克隆,构建DNA重组体,构建工程菌,目的基因的表达,外源基因表达产物的分离纯化,产品的检验,14,医学ppt,基因工程药物制造的主要步骤目的基因的克隆14医学ppt,制备基因工程药物的基本过程,获得目的基因,组建重建质粒,构建基因工程菌,培养工程菌,产物分离纯化,除菌过滤,半成品检定,成品检定,包装,15,医学ppt,制备基因工程药物的基本过程获得目的基因组建重建质粒构建基因工,基因工程的上游和下游,目的基因,载体,重组,DNA,分子,重组,DNA,进入宿主细胞,转化,/,转染,工程菌大规模培养,表达,产物分离纯化,诱导,上游,下游,实验室,工厂化、产业化、商口化,16,医学ppt,基因工程的上游和下游目的基因载体重组DNA分子重组DNA进入,基因工程重组菌构建示意图,17,医学ppt,基因工程重组菌构建示意图17医学ppt,上游阶段：,主要是,分离目的基因、构建工程菌,(,细胞,),。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。,下游阶段：,从,工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制,。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。,基因工程药物生产的上游和下游,18,医学ppt,上游阶段：基因工程药物生产的上游和下游18医学ppt,第三节 目的基因的获得,克隆基因的常用方法：,基因组文库法（原核）,反转录法（真核）,PCR,法（原核,+,真核）,反转录,-,聚合酶链反应法（真核）,化学合成法（原核,+,真核）,旧基因改造法（原核,+,真核）,19,医学ppt,第三节 目的基因的获得克隆基因的常用方法：19医学ppt,一 构建基因组文库分离目的基因,基因组,DNA（genomic DNA）,：,指代表一个细胞或生物体,整套遗传信息,（染色体及线粒体）的,所有,DNA,序列,。,基因组文库：,将某种细胞的,基因组,DNA,切成一定大小的,片段,，并与适当的,载体重组,后导入,宿主细胞,，这种含有,整个基因组,DNA,信息,的,集合。,20,医学ppt,一 构建基因组文库分离目的基因 基因组DNA（genomic,基因组文库（,DNA,文库）构建流程,分离基因组,DNA,限制酶,大小不同酶切片段 片段酶切、回收、纯化,分别与适当的载体连接 载体,DNA,连接酶,导入细胞 转化或转染,克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑,鉴定 分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定,筛选,根据基因决定筛选策略,21,医学ppt,基因组文库（DNA文库）构建流程 分离基因组DNA筛选根据,基因组文库法只适合原核基因的获得，不适用于真核基因。,Notice:,Why,?,22,医学ppt,基因组文库法只适合原核基因的获得，不适用于真核基因。Noti,原核基因与真核基因的区别,真核基因有,内含子,真核细胞中单拷贝基因只是染色体,DNA,中,很小一部分,，为其,10,-5,-10,-7,，即使多拷贝基因也只有,10,-5,，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极其困难,真核基因的反转录克隆法,23,医学ppt,原核基因与真核基因的区别真核基因有内含子真核基因的反转录克隆,二 反转录法,从真核细胞中提取,mRNA,，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成与该,mRNA,互补的,DNA,（,cDNA,第一链），再以,cDNA,第一链为模板，最终合成双链,DNA,序列。,cDNA,不含内含子。,获得,cDNA,文库。,24,医学ppt,二 反转录法从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶,反转录合成基因的步骤：,mRNA,的纯化 ,cDNA,第一链的合成 ,cDNA,第二链的合成 ,cDNA,的克隆 将重组体导入宿主细胞 ,cDNA,文库的鉴定 目的,cDNA,克隆的分离和鉴定,25,医学ppt,反转录合成基因的步骤：mRNA的纯化,cDNA,克隆示意图,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,逆转录酶,ds-cDNA,ds-cDNA,RNaseH,酶解除去,mRNA,DNA,聚合酶,I,核酸酶,S1,26,医学ppt,cDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNA逆转录酶ds-,1.mRNA的纯化,细胞内含有3种以上的,RNA,，,mRNA,占细胞内总,RNA,总量的2%5%，,真核细胞中,mRNA,的3,-,末端含有一多聚腺苷酸,polyA,组成的末端，足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸,Oligo(dt)-,纤维柱上，可用亲和层析法将,mRNA,从细胞总,RNA,中分离出来。,27,医学ppt,1.mRNA的纯化细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细,2.,cDNA,第一链的合成,可用寡聚脱氧胸苷酸（,dt,）作为引物，在反转录酶作用下，开始,cDNA,链的合成。,3.cDNA,第二链的合成,除去,cDNA-mRNA,杂合链中的,mRNA,链（碱解或,RNaseH,酶解）,然后以,cDNA,第一链为模板开始合成,cDNA,第二链。由于第一链,cDNA3-,末端会形成发夹结构，所以可从这点开始合成第二链（,Klenow,酶或,DNA,聚合酶,I,）,切除发夹结构（核酸酶,S1,，专一性切除单链,DNA,）,28,医学ppt,2.cDNA第一链的合成可用寡聚脱氧胸苷酸（dt）作为引物,4.cDNA克隆,用于,cDNA,克隆的载体有两类：,质粒,DNA,（,如,pUC,、,pBR322,等）,10kb,根据重组后插入的,cDNA,能否表达、转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为：,表达型载体,（,pUC,、,gt11,）有启动子,非表达型载体,（,pBR322,、,gt10,）,29,医学ppt,4.cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：29医学pp,5.,将重组体导入宿主细胞,以转化或转染的方向使重组,DNA,进入宿主细胞。,6.cDNA,文库的鉴定,目的：评价库的好坏,表型改变,抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变,结构特征,凝胶电泳、分子杂交、,DNA,序列分析,30,医学ppt,5.将重组体导入宿主细胞以转化或转染的方向使重组DNA进入,7.目的cDNA克隆的分离和鉴定,核酸探针杂交法,根据目的蛋白质的,氨基酸序列,，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，众,cDNA,文库中分离特异的,cDNA,克隆。,免疫反应鉴定法,用表达型载体构建的,cDNA,文库，可用免疫学方法逐一鉴定各,cDNA,的表达产物，即以某种蛋白质的,抗体,寻找相应的,cDNA,克隆。,31,医学ppt,7.目的cDNA克隆的分离和鉴定核酸探针杂交法31医学