实验六 IEF-PAGE (2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,IEF-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE),两性电解质和,pH,梯度的形成,pH,梯度的测定,样品等电点的计算,IEF-PAGE,原理,聚丙烯酰胺等电聚焦电泳,(,Isoelectric,Focusing-PAGE,，简称,IEF-PAGE),原理：,（,1,）两性电解质载体,(carrier,ampholytes,),，两性电解质载体在电场作用下，按各自,pI,形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的,pH,梯度。,（,2,）在电场作用下，蛋白质在此,pH,梯度凝胶中泳动，当迁移至周围的,pH,值等于该蛋白质的等电点处时，蛋白质此时不带电荷，停止泳动，进而被浓缩成狭窄的区带。,（,3,）常用的,pH,梯度电泳支持物有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。支持物的作用是为了防止在正负极之间形成对流。,两性电解质（,carrier,ampholyte,CA),两性电解质,：由多种氨基与羧基比例不同的脂肪族多氨基多羧,酸同系物和异构物混合构成。当电场中通直流电时，它们依各,自氨基与羧基比例的不同而按其等电点的次序排列，从而在两,极间形成,一个稳定的由阳极到阴极逐渐增加,pH,的平滑梯度。,商品名为,Ampholine,。,理想载体两性电解质的条件,：,1,、分子量小，,可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。,2,、可溶性好，便于等电聚焦过程中,pH,梯度的形成和蛋白质样品的迁移。,3,、缓冲能力强，避免聚焦的蛋白质在等电点引起,pH,梯度的局部改变和溶解性能的下降。,4,、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。,5,、紫外吸收低，不发荧光。,6,、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。,理想的载体两性电解质的合成,用具有几个,pH,值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六,胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生,加合反应,：加合,反应优先加在,、,饱和酸的,碳原子上，调节胺和酸的比,例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机合成,不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里,要求,合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证,的很多具有不同而又互相接近的,pK,值和,pI,值，从而得到平滑,的,pH,梯度。,载体两性电解质的等电点在,pH3-10,的范围，分子量在,300-1000,之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性,能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好，,在,1%,水溶液中的紫外吸收值（,260nm,）很低。,（,1,）正负极间引入等电点彼此接近的一系列,两性电解质,的混合物（即在灌制聚丙烯酰胺凝胶的时候将两性电解质加到未聚合的凝胶中，聚合后，在凝胶中即形成了两性电解质的混合物）；,（,2,）在,正极端,引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在,负极端,引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。,（,3,）,电泳,开始前两性电解质的混合物,pH,为一均值，即各段介质中的,pH,相等，用,pH0,表示。,（,4,）电泳开始后，混合物中,pI,最低,的分子，带,负电荷最多,，,pI1,为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，,pH,突然下降，甚至接近或稍低于,PI1,，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。,（,5,）由于两性电解质具有一定的,缓冲能力,，使其周围一定的区域内介质的,pH,保持在它的等电点范围。,（,6,）,pH,稍高的,第二种两性电解质,，其等电点为,pI2,，也移向正极，由于,pI2,pI1,，因此定位于第一种两性电解质之后。,（,7,）,以此类推,，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性,pH,梯度。,两性电解质在电流的作用下现场平滑的,pH,梯度,pH,梯度的建立,IEF-PAGE,的优点和应用,优点：分辨率高（,0.01pH,），抵消扩散作用，可使很稀的样品达到高度的浓缩，并同时测定等电点。特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。,缺点：,1,、聚焦要求用无盐溶液，在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，,2,、样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶,或发生变性的蛋白质。,应用：,1,、分析和制备。,2,、测定等电点。,注意：有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱，占据了分离的有效部位。色素和酚类物质也会影响结果。同时要加入蛋白质水解的抑制剂。此外，两性电解质的好坏是聚焦好坏的关键之一。加样体积不受限制，最高可达,80-85,毫升。,等电聚焦示意图,双向电泳示意图,双向电泳图谱,电泳装置,操 作 方 法,1.,凝胶柱的制备,（,1,）玻璃管先用小片的封口膜封口，然后将封口的一端插在橡皮帽中,(,与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加,2-3,滴,30%,的甘油或者,40%,蔗糖,),（,2,）配胶,（按照黑板上的配方加入相应的溶液）,表,凝胶的配制,试 剂 名 称 体积,(,mL,),30%,凝胶贮存液,1.2 ml,蒸馏水,2 ml,2mg/ml,蛋白质样品,1.5 ml,40%,两性电解质载体,0.48 ml,TEMED 0.004 ml,充分混匀后,加入,10%,过硫酸铵,0.04 ml,（,3,）将配好的凝胶溶液,混匀后,用滴管加到预先准备好的玻管中，,使凝胶层达,8,cm,，再缓缓加水,3-5 mm,高。,（,4,）凝胶聚合,30min,，水与凝胶出现分层界面表示聚胶完成。,2.,电泳,小心地从橡皮帽中拔出玻管，,用滤纸吸去水层，,并用蒸馏水洗去,甘油或者蔗糖,溶液，然后将玻璃管固定到电泳槽上洞中,（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）,。,在上槽中加入,5%,磷酸缓冲液，接电泳仪的正极,。,在下槽中装入,2%,氢氧化钠溶液,，,接负极。,避免管下有气泡（,可先用吸管吸取氢氧化钠溶液加到玻璃管的下端，然后再将电泳槽安装好；再在槽的上面加磷酸缓冲液，注意同样用吸管吸取磷酸缓冲液加到玻璃管中,）,。打开电源，调电压至,16,0 V,，电泳,3.5,小时后,将电压调至,0,（在此过程中电流逐渐降低，直到接近,0mA,），关闭电源。,3,剥胶,电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，,在凝胶条的正极端作标记,。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边注入水边推针前进，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，然后用吸耳球将凝胶柱轻轻压出。,4.,染色,取其中一条凝胶条放入考马斯亮蓝染色液中固定过夜。凝胶条置于玻璃板上，,量出蛋白带距正极端的距离（,L1,）和凝胶条的长度（,L2,）。,5.pH,梯度的制作,另外一条凝胶条放在玻璃平皿中，测量长度为,L4,。从凝胶的正极端开始，每隔,0.5 cm,切下一段，依次放入已编好号并装有,1ml,蒸馏水,的,1.5ml,离心管中，浸泡过夜。次日分别测定每管,pH,值。以凝胶长度为横坐标，,pH,值为纵坐标，绘制标准,pH,梯度曲线。,6.,蛋白质样品等电点的计算,根据蛋白质聚焦部位（在测定,pH,那只凝胶条中蛋白质距凝胶条正极端的长度为,L3,，,L3,是根据,L1,、,L2,和,L4,的测量数据计算出来的数值），直接从,pH,梯度曲线上求出该蛋白质等电点。,L1/L2=L3/L4,pH,梯度的测定,阴极,阳极,影响等电聚焦的因素,1,、支持介质：无电内渗的高纯度的稳定介质。,2,、两性电解质载体：直接影响,pH,梯度的形成和蛋白质的聚焦。,3,、电极溶液：应选用在电极上不产生易挥发物的液体。电极溶液的作用是避免样品及两性电解质载体在阴极还原或在阳极氧化，其,pH,应比形成,pH,梯度的阴极略高，比阳极略低。,4,、丙烯酰胺的聚合,5,、,TEMED,：可扩展凝胶碱性端的,pH,梯度。加入后对于分析碱性蛋白质有利。,6,、电流、电压和温度,7,、样品与处理与加样的方法：,样品预处理：盐离子可干扰,pH,梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行,IEF-PAGE,时，样品应透析或用,SephadexG-25,脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。,加样量的确定：加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝,R-250,染色，加样量可为,50-150,g,；如用银染色，加样量可减少到,1,g,。一般样品浓度以,0.5-3 mg/,mL,为宜，最适当加样体积为,10-30,l,。,8,、电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在,10%-15,的三氯乙酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。我们使用的是改良的考马斯亮蓝染液，染色的同时进行脱色。,影响等电聚焦的因素,解 疑,1,、在电压达到预定值后，电流为什么会降低？,答：当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的,pH,值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。,2,、为什么在两个电极丝附近有气泡产生？,答：等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的,pI,值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。,思 考,进行,IEF-PAGE,时的注意事项有哪些？,IEF-PAGE,最新研究动态及其应用？,